イネ構造ゲノム解明に向けての発現、精製、立体構造解析に関する研究

• 課題番号: 2002002707
• 研究機関名: 農業生物資源研究所
• 研究分担: 農業生物資源研究所 植物生命科学研究部門 生体高分子研究グループ 蛋白機能研究チーム; 農業生物資源研究所 植物生命科学研究所 生体高分子研究グループ 蛋白機能研究チーム; 農業生物資源研究所 植物生命科学研究部門 生体高分子研究グループ 超分子機能研究チーム
• 研究期間: 継続2001～2002
• 年度: 2002
• 摘要: イネゲノム研究プロジェクト参画者から構造解析蛋白質を公募し、14グループから29蛋白質が提案された。そのなかからドメインを含む48サンプルについて大量発現系の構築と精製条件の検討を行い、11種類について立体構造解析に必要な高純度蛋白質が大量に得られる条件を確立した。発現系の構築において煩雑なサブクローニング行程を簡略化・効率化する目的で、Gateway systemの導入を検討した。市販の発現ベクターを利用した場合、発現効率と蛋白質の可溶化効率が低かったが、発現量の多いT7 プロモーターと可溶化率の高いthio-redoxinをコードするpET32aをGateway systemの発現ベクターとして改変した結果、発現効率と蛋白質の可溶化効率が著しく向上した。さらに、この方法を用いた場合の欠点である目的蛋白質のN末端に付加するアミノ酸23残基を除去するために、酵素消化サイトの導入を検討した。この結果、目的蛋白質のみが精製出来ること、適切な酵素消化サイトと蛋白質の組合せにより、発現しない蛋白質や不溶性蛋白質が可溶性蛋白質として発現することが新たに見い出された。本研究で開発したサブクローニング法を利用することにより、従来1割以下といわれていた蛋白質の可溶化率が6割近くに向上した。