リンゴさび果ウイロイドのＲＮＡプローブによる遺伝子診断法

• 担当機関: 果樹試験場
• 研究期間: 1996～1998
• 発行年度: 1996
• 要約: ＤＩＧ標識ＲＮＡプローブを用いたリンゴさび果ウイロイド（ＡＳＳＶｄ）の遺伝子診断は、リンゴ樹の樹皮を検定試料として用いることにより、一度に多数の診断が行え、検出感度も高く、実用性の高い診断法である。
• 背景・ねらい: リンゴさび果病病原体のＡＳＳＶｄの検定法として、放射性同位元素標識の核酸プローブを用いた遺伝子診断法があり、高感度な診断法として知られているが、特別な施設を必要とする。近年、ＤＩＧやビオチンを標識した非放射性標識ＤＮＡプローブによる遺伝子診断法が一般化しつつあるが、さらに高感度であるといわれるＲＮＡプローブ（ＤＩＧ標識）を用い、ＡＳＳＶｄの迅速で、高感度の診断法の開発、実用化を行った。

成果の内容・特徴

1. 　 プラスミドベクターの pBluescript Ⅱ ＳＫ（－）のHinc Ⅱ サイトにＡＳＳＶｄの全長のｃＤＮＡが組み込まれたクローンを用い、Ｔ３あるいはＴ７ＤＮＡ依存ＲＮＡ合成酵素によりＤＩＧ標識ｃＲＮＡプローブを作製し、ＡＳＳＶｄ感染リンゴ樹から抽出した核酸試料を、ナイロンメンブレンにスポットし、ドットブロットハイブリダイゼーションによりＡＳＳＶｄを検出できた。
   
2. 　ＡＳＳＶｄ感染樹「印度」のさび果症状を示す果実及び健全「印度」果実の果皮を用いて検出を行ったところ、感染樹から抽出された核酸試料にのみシグナルが検出され、健全樹の核酸試料ではシグナルが検出されなかった。
   
3. 　ＡＳＳＶｄ感染樹「印度」の樹皮、葉柄、葉、果実を用い、検出を行ったところ、いずれも高感度の検出が可能であったが、果実からの核酸試料でやや感度が劣った（図１）。
   
4. 　９分離株を用い、葉及び樹皮から核酸試料を抽出し、ＡＳＳＶｄの検出を行ったところ、樹皮から抽出された核酸試料では、いずれの分離株も高感度で検出されたが、葉から抽出した核酸試料では分離株により差が認められた（図２）。
   

• 成果の活用面・留意点: 分離株あるいはリンゴ品種が異なると、葉から抽出した核酸試料では検出感度に差を生じる場合があるので（図２）、信頼性の高い結果を得るには、材料として樹皮を用いる必要がある。
• カテゴリ: サビ果 品種 りんご