コムギのAFLP マーカーを効率的にSTS 化するためのExtension-AFLP 法

• 担当機関: （独）国際農林水産業研究センター
• 研究期間: 2001～2005
• 研究担当者: 許東河; 坂智広
• 発行年度: 2003
• 要約: の選抜プライマーに塩基を付加した4 種の3 次選抜プライマーを用いてnestedPCR を行うExtension-AFLP 法AFLP
• 背景・ねらい: AFLP（増幅断片長多型）マーカーをSTS（Sequence Tagged Site）化してゲノムDNA からその特定配列をPCR ; で増幅できるSTS マーカーに移行するには、AFLPターゲットバンドをサブクローニングして塩基配列を特定しPCR プライマーをデザインする。ゲノムサイズの大きいコムギでは、AFLP ; のターゲットバンドに複数のゲノム領域のコピーが含まれるため、複数シークエンスからターゲット領域の配列を選び出すのが困難である。またSTS ; 化の過程でデザインしたプライマーを用いても、ターゲットの断片長多型を消失してしまうなどSTS 化が非常に困難である。そのため、コムギのAFLP ; マーカーを効率的にSTS 化するExtension-AFLP 法を開発した。

成果の内容・特徴

1. Extension-AFLP 法は、AFLP マーカーの選抜プライマー（selective primer）にA,T,G,C
   の塩基をそれぞれ付加した4 種の3 次選抜プライマーを用いてnested PCR を行う。その中から多型を示すターゲットDNA
   断片を増幅する選抜性の高いプライマーを選び、この操作を繰り返すことでゲノムからターゲット領域の配列を効率的に選抜する方法である。
   
2. AFLP マーカーをサブクローニングする際のターゲットクローンの割合（E-ACT/M-CGAC118-120 が15.6％、E-AAC/M-CGAC285
   は37.5％）が、3 回のExtension-AFLP 操作により単一のターゲット領域の配列を選択的に選び出すことが可能で（93.8％及び87.5％）、後は従来通りシークエンスおよびPCR
   プライマーデザインすることで、従来法よりも効率的にSTS マーカーを開発できる（図1 ）
   
3. Extension-AFLP 法により、コムギの赤かび病抵抗性QTL に大きく寄与する3 BS 染色体の2 つのAFLPマーカーがSTS
   化（STS-118-120、STS285）でき、ターゲット領域の配列の増幅と多型が検出できる（図2，3）
   
4. AFLP マーカーが優性マーカーの場合PCR失敗によるバンドの欠失の見分けが困難であるが、同時に第3のプライマーを用いて共通の増幅断片を得ることで優性マーカーでも分離が確認できる（図3）
   

成果の活用面・留意点

1. Extension-AFLP による効率的なSTS 化法は、コムギ以外の場合にも適用できる。
   
2. 2. AFLP際の制限酵素認識サイトに欠失がある場合は、Extension-AFLP 法でもSTS 化が困難な場合がある。
   

• カテゴリ: 抵抗性