RT-PCRによるサツマイモ斑紋モザイクウイルス(SPFMV)検定法の改良

• 担当機関: 宮崎県総合農業試験場
• 研究期間: 1999～1999
• 発行年度: 1999
• 要約: RT-PCRによるSPFMVの検定において、RNA抽出法としてISOGENを用い、逆転写酵素としてAMV逆転写酵素を使用した場合、反応液100μL中総RNA量0.2pgまで検出可能である。宮崎県総合農業試験場・生物工学部・遺伝子工学科
• 背景・ねらい: 現在、かんしょウイルスフリー苗の検定を含めたサツマイモ斑紋モザイクウイルスの検定は、RT-PCR法、電子顕微鏡法、植物検定法等があるが、検定の困難なウイルスである。その中で、RT-PCRによるウイルス検定法の改良として、RNA抽出法及び逆転写酵素の比較を行い、さらに高感度の検定法を選定する。

成果の内容・特徴

1. 生葉0.1gからのRNA抽出は、すでに報告のあるSDS-phenol法、CF-11法に比べ、ISOGENにおいて、高分子から低分子までのRNA（図1）が最も少ない手順で抽出できる。
2. 各RNA抽出法により抽出したRNAを鋳型にして、表1のSPFMV強毒系統及び普通系統共通プライマーを用い、rTth DNA合成酵素によるRT-PCRを行った結果、ISOGEN及びSDS-phenol法が感度が高く、反応液100μL中粗RNA量2pgまで検出可能である（表2）。
3. 3種類の逆転写酵素を使用して、表1のプライマーによりRT-PCRの比較を行った結果、AMV逆転写酵素とTaq DNA合成酵素の組み合わせが最も感度が高く、反応液100μL中粗RNA量0.2pgまで検出可能である（表3）。
4. AMV逆転写酵素とTaq DNA合成酵素の組み合わせによるRT-PCR条件は以下のとおりである。
   cDNA合成：摂氏48度/15分間摂氏-99度/5分間。PCR：摂氏95度/2分間、摂氏95度/1分間摂氏-60度/1分間・40反復、摂氏60度/7分間。
   

成果の活用面・留意点

1. 茎頂培養苗の鉢上げ後のウイルス検定に用いる場合、塊根を経由せず検定可能である。
2. 種苗増殖施設などで使用する。
3. 異なったプライマーを用いた場合、PCR条件の再検討が必要である。

• カテゴリ: かんしょ