NMRにおける飽和移動差スペクトル(STD)法によるジベレリンのエピトープ解析

• 研究期間: 2003～2005
• 研究担当者: 逸見光; 吉田充; 山口五十麿(東京大学大学院農学部); 村田貴志; 中嶋正敏(東京大学大学院農学部)
• 発行年度: 2004
• 要約: 核磁気共鳴(NMR)における飽和移動差スペクトル(STD)法を用いることにより、抗体に結合する植物ホルモンジベレリン(活性型ジベレリン)を迅速にスクリーニングし、抗体との相互作用部位の同定も可能になる。
• キーワード: saturation transfer difference (STD)、飽和移動差スペクトル法、核磁気共鳴、NMR、エピトープ解析、ジベレリン
• 背景・ねらい: ジベレリン(GA)は、植物の伸長生長などに関与する植物ホルモンで、120種類を超える類縁化合 物が存在する。しかしながら、そのうちの数種のみ(活性型 GA)が、GA レセプターに作用し、生理 活性を発現すると考えられている。GA レセプターは、未だ同定されていないため、GA レセプターの ように活性型 GA を特異的に認識する抗 GA 抗体を用いて研究が行われている。その抗 GA 抗体に対 する各種ジベレリンの結合活性及び抗体認識部位については、これまで交差反応解析法により行われ てきたが、その操作は煩雑でしかも時間がかかるため、より効率的な測定法が求められていた。最近、 核磁気共鳴(NMR)を用いたリガント-タンパク質間におけるリガント側の認識部位(エピトープ) 解析法として、飽和移動差スペクトル(STD)法が開発され、主に糖-タンパク質間における糖側の エピトープ解析が行われてきた。そこで、この STD 法が、抗 GA 抗体に対する GA結合活性及びエ ピトープ解析を簡便かつ短時間で行うことが可能かどうか検討を行った。
• 成果の内容・特徴: 1.活性型 GA である GA3(図1 A)と抗 GA 抗体との混合液(混合比=100:1)について、リ ファレンスとして通常の1次元 NMR スペクトル(図1 B)と STD 法による NMR スペクトル(STD - NMR スペクトル)を測定した(図1 C)。STD - NMR スペクトルにおいては、GA3 由来のシ グナル以外観測されなかったことから、抗体との結合活性を持つ活性型 GAスクリーニングに 応用可能であると考えられた。; 2.STD 法では、タンパク質との距離が近いリガントの部位ほどタンパク質からの磁化移動率が大き いためシグナル強度が高まるという現象を利用して、エピトープ解析を行う。そこで、STD - NMR スペクトル中の GA3 由来の各シグナルの面積積分値から抗体認識部位を推定した(図2)。図2 で示してあるように、抗体は GA3A,B,Cの各リングを認識し、Dリングを認識していない こと、さらに、GA3β表面側が抗体との結合に重要であることが分かった。この結果は、すで に結晶構造解析により報告されている GA抗体認識部位と非常に良い一致を示し、STD 法によ り容易に抗 GA 抗体との認識部位を解析可能であることが示された。; 3.本法において、サンプル調製は基本的に GA と抗体を混合するだけで、また STD - NMR スペク トルの測定は数十分で終了することから、簡便かつ短時間でエピトープ解析用のデータを取得で きる。
• 成果の活用面・留意点: 本法は、GA 以外の植物ホルモンのタンパク質との相互作用解析にも応用可能である。ただし、STD - NMR スペクトルは感度が低いため、高感度の NMR 装置が必要である。