ウシ胎仔脳細胞の初代培養と凍結保存技術の開発

• 担当機関: （現
• 研究期間: 1995～1997
• 発行年度: 2000
• 要約: ウシ胎仔脳を材料として，神経細胞，アストログリア，ミクログリア等を初代培養する技術を開発した。また，胎仔脳組織を液体窒素中で凍結保存した後でも，ほぼ同様に初代培養が可能であった。
• 要約(英語): Procedures for primary cultures and cryopreservation of bovine brain cells were established as in vitro experimental systems, to study the responses of bovine brain cells to neuropathogenic agents. Brain cells were dissociated by papain from the cerebellum of bovine fetuses at 90-120 days of age, and were cultured in different media. In medium containing 1% fetal bovine serum (FBS), neuronal cells were maintained and they formed clusters on glial and fibroblastic cell sheets. In medium containing 10% FBS, the proportion of neurons decreased, and fibroblastic and microglial cells dominated. In serum-free medium containing epidermal growth factor, the highest neuronal proportion was obtained. Optimal cryoperservation conditions for the brain tissues were investigated by changing the concentrations of DMSO and FBS. Brain cells could be cultured from cryopreserved tissue with only slightly reduced growth profiles and varying cell proportions in comparison to those prepared from fresh tissue. (Department of Molecular Biology and Immunology, National Institute of Agrobiological Sciences (NIAS) Tel:[phone]); References:; 1) A. Hashimoto, T. Onodera, H. Ikeda and H. Kitani: Isolation and characterisation of fetal bovine brain cells in primary culture. Res. Vet. Sci. 69: 39-46 (2000); 2) I. Yamane, H. Kitani, T. Kokuho, T. Shibahara , M. Haritani, T. Hamaoka, S. Shimizu, M. Koiwai, K. Shimura and Y. Yokomizo: The inhibitory effect of interferon gamma and tumor necrosis factor alpha on intracellular multiplication of Neospora caninum in primary bovine brain cells. J. Vet. Med. Sci. 62: 347-351 (2000); 3) H. Kitani, M. Yamakawa and H. Ikeda: Preferential infection of neuronal and astroglia cells by Akabane virus in primary cultures of fetal bovine brain. Vet. Microbiol. 73: 269-279 (2000)
• 背景・ねらい: ウシ胎仔に大脳欠損等の異常を引き起こすウイルスが知られているが，これらのウイルスの影響を詳細に解析するための中枢神経系細胞の初代培養技術は，ウシではまだ確立されていない。そこで，ウシ胎仔脳を材料として，神経細胞，アストログリア，ミクログリア等を初代培養する技術の開発を目指した。また，この初代培養技術をより広範な研究に適用可能とするために，ウシ胎仔脳組織の凍結保存技術についても検討した。

成果の内容・特徴

1. 胎齢１２０日前後のウシ胎仔小脳皮質をパパイン処理し，ウシ胎仔血清（FBS）を含む培地，あるいは上皮成長因子（EGF）を添加した無血清培地などで培養したところ，いずれの場合も神経細胞，アストログリア，ミクログリア等が培養できた（図１）。無血清培地を用いた場合では，神経細胞の占める割合が最も高くなり，一方FBSを含む培地ではアストログリアやミクログリアの占める割合が高くなった（図２Ａ）。
   
2. 細切したウシ胎仔脳組織をジメチルスルフォキシド(10%)とFBS(10%)を含む凍結用培地に縣濁して凍結した。これらの胎仔脳組織を解凍して用いた場合でも，神経細胞，アストログリア，ミクログリアは，新鮮な脳を用いた場合とほぼ同程度の割合で培養できた（図２Ｂ）。このことから，凍結保存したウシ胎仔脳組織から必要に応じて脳細胞を初代培養し，種々の解析に用いることができると示唆された。
   

成果の活用面・留意点

1. この初代培養系を用いて，ウシの中枢神経系に異常を引き起こすウイルスや原虫等の挙動や脳細胞へおよぼす影響などについて詳細に解析することができる。
   
2. ウシ胎仔脳組織を液体窒素中で凍結保存しておき，いつでも必要に応じて培養を開始し，種々の試験に用いることができる。