RLGS法の改良と画像解析によるイネ品種間の遺伝的多型分析

• 担当機関: 四国農業試験場
• 研究期間: 1996～1997
• 発行年度: 1996
• 要約: ＲＬＧＳ法を改良し画像解析装置と組み合わせた解析法を確立し、それによって遺伝的に近縁な日本のイネ品種間でＤＮＡレベルでの遺伝的多型を効率的に検出することができる。
• 背景・ねらい: 特定の品種の間で多数の多型的なＤＮＡマーカーを得ることが個々の形質の遺伝; 分析や遺伝的多様性の把握において重要である。しかし、日本のイネ品種のよう; に遺伝的近縁性の高い品種間でＤＮＡレベルでの遺伝的多型を多くの遺伝子座に; ついて検出するためには、ＲＦＬＰやＰＣＲを用いた分析法では同じ実験操作を; 繰り返し行ってスクリーニングする必要があり、効率的でない。そこで、多型検; 出能力を向上させるため、新しいＤＮＡフィンガープリントとしての可能性をす; でに確認したＲＬＧＳ（ゲノム・スキャニング）法の実験手順を簡便化し、画像; 解析装置と組み合わせる。

成果の内容・特徴

1. ＲＬＧＳ改良法（浅川1996）をイネＤＮＡの解析のために改変し、得られたＲＬＧＳプロファイルを画像解析装置で解析する。イネＤＮＡ250ngをNotI、EcoRVで同時に消化後RIで標識化する。そのうちＤＮＡ100ngをアガロース・ゲル電気泳動（１次元目）し、ゲルのままMboIで消化し、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（２次元目）する。ゲルを乾燥後オートラジオグラフィでＸ線フィルムに感光させる。得られたＲＬＧＳプロファイルを画像解析装置（東洋紡、解析ソフトウェアはPDI社PDQUEST ver. 5.1 PC version）のスキャナーで取り込み、バックグラウンドを除去し、スポットの位置と強度を検出し、特定の品種間で比較する。
   
2. ＲＬＧＳ改良法と画像解析装置を用い、相互に近縁な日本の在来品種（愛國、旭、十石、亀治、亀ノ尾、大場、竹成、神力）のＲＬＧＳプロファイルから約1,000個の明瞭なスポットの見られた領域を選び解析する。任意の２品種間の比較では各品種に特異的なスポットの和が平均約166個検出でき、各品種間の類似度を計算するといずれも0.902から0.928という値が得られる（表１）。
   
3. 同じ領域を兄弟品種であるコシヒカリ、越路早生、ハツニシキ、ホウネンワセ、ヤマセニシキ、ならびにひとめぼれ、ササニシキを調査すると、ＲＬＧＳプロファイルはきわめてよく似ているがそれぞれの品種を明瞭に識別できる。その類似度は在来品種間よりも高く、0.936から0.959である（表２）。
   

成果の活用面・留意点

1. イネ以外の作物にも応用可能である。ゲノムサイズに応じて供試ＤＮＡ量ないしはオートラジオグラフィの時間を調整する必要がある。
   
2. 現段階では電気泳動の解像度による検知限界や機械的なスポットの認識の過程で生じる誤差（誤認識）を完全には排除できないため相互に異なるスポットの数を過大に評価し品種の類似度を過小に評価している可能性は残る。
   

• カテゴリ: 乾燥 DNAマーカー 品種