③ 家畜の発生分化機構の解明

• 課題番号: 2013023131
• 研究機関名: 農業生物資源研究所
• 研究分担: 徳永 智之; 内藤 充; 金子 浩之; 野口 純子; 菊地 和弘; 松原 悠子; 伊藤 嘉保; 細江 実佐; 古澤 軌; 大越 勝広; 宮下 範和
• 協力分担関係: 麻布大学
• 研究期間: 2011-2015
• 年度: 2013
• 摘要: １． ウシにおいて、ES細胞等の多能性幹細胞から生殖細胞、さらに交配能力のある配偶子を分化誘導するための基盤技術の開発を進めており、その一環として生殖細胞で特異的に蛍光タンパク質を発現する遺伝子組換えウシの作出に取組んでいる。今年度は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)による相同組換えによって、生殖細胞特異的に発現するDDX4遺伝子を赤色蛍光タンパク質遺伝子(DsRed)に置換したウシ線維芽細胞を樹立した。これを核移植に供してクローン胎子を作出した。その遺伝子解析を行ったところ、片側アリルでは期待通りのノックインが起こっている一方、もう片側のアリルにおいて欠失が起きていることが判明した。クローン胎子の生殖腺の形態は正常で、qRT-PCRによって僅かなDsRed遺伝子の発現が認められたが、蛍光は検出できなかった。また、DDX4遺伝子の発現も認められず、本胎子がDDX4遺伝子ノックアウト個体であることが明らかとなった。ノックイン個体を得るには、さらなる実験が必要であるが、ウシにおいてもZFNアシ ストによる高度なゲノム編集が可能であることが示された。; ２． 前年度、超低温保存、異種間移植及び顕微授精を組み合わせた新しい繁殖システムによって、本来精子を作れない幼若ブタでも、長 期保存した精巣組織から直接次世代を生産できることを示した。本年度は、本システムで生産された子ブタを用いて、１）性成熟過程の内分泌的なモニター、２）交配及び体外受精を用いた繁殖能力の評価、３）性成熟後の精巣の形態解析を行った。その結果、超低温保存した幼若期精巣に由来するブタは、正常な性成熟過程を経た後、正常な繁殖能力を獲得することが明らかとなり、新しい繁殖システムの実用の可能性が示された。; ３． 前年度、１か月齢子ウシ由来精巣組織の異種間移植を試みたところ、伸長精子細胞及び成熟精子の形成が確認されたが、精子が得ら れる頻度は低かった。本年度は、精巣組織移植後のヌードマウスに対する性腺刺激ホルモン放出ホルモンの徐放性投与により、精子形成を向上させ得るか否か、その可能性を検討した。その結果、減数分裂を経た円形精子細胞が得られる割合が向上した。精子形成の頻度も改善し、運動性を持った精子も得られることが判明した。今後、より最適なホルモン処理条件を設定することにより、顕微授精に供し得る量の精子が得られると期待される。; ４． ニワトリ胚から取り出した始原生殖細胞を体外で培養増殖させる方法を構築し、始原生殖細胞操作のための基盤技術の開発を進めて いる。本年度は、始原生殖細胞を大量に培養した後、エレクトロポーレーション法によりGFP遺伝子の導入を試みた。その結果、培養始原 生殖細胞でGFP遺伝子の発現が観察された。GFP遺伝子を発現する培養始原生殖細胞をレシピエントニワトリ胚へ移植した結果、生殖巣でのGFP発現が観察され、遺伝子導入始原生殖細胞が生殖巣への移住能を有していたことが確認された。これらの成果は、培養始原生殖細胞を 利用した遺伝子組換えニワトリ作出技術の基盤となる。
• カテゴリ: 鶏 繁殖性改善 豚