蛋白質工学による有用プロテアーゼインヒビターの機能と構造の解析（１９５）

• 課題番号: 203
• 研究機関名: 食品総合研究所
• 研究分担: 応微・発酵細菌研
• 研究期間: 完（８～９）１０～１１
• 年度: 2000
• 摘要: 8年度において、鳥卵中に存在するペプチド性インヒビターをより熱安定性の高いものにするため、新たにジスルフィド結合を導入した変異体を大腸菌の発現系で作製した。また、プロリンをアラニンに置換して変異体も作製した。それら変異体はほとんどのタンパク質分解酵素に対して野生体と同じ阻害能を示したが、一部のタンパク質分解酵素に対してはジスルフィド結合を導入した変異体のみ阻害能が失われた。9年度において、途中で研究が中断されるまでに円偏光二色法を用いて熱安定性を測定した。アラニンに置換した変異体は、野生体らに比べ約７℃熱安定性が向上した。さらに、核磁気共鳴法を用いてそれらの立体構造の解析を行った。研究再開後、11年度までに、それらの立体構造を解明した。その結果、野生体とアラニンに置換した変異体ではほとんどその立体構造は同じであること、また、ジスルフィド結合を導入した変異体ではN末端のループ部分がジスルフィド結合により大きく構造変化したことが分かった。こられの結果より、熱安定性の要因は、単にプロリンをアラニンに置換することによるエントロピー効果によるもの、また、阻害活性特異性の変化の要因はジスルフィド結合導入によるN末端の構造変化によることが判明した。これらの研究の成果は学術的に新規の発見であるとともに、より熱安定な有用酵素作製のための大変重要なデータである。