分子レベルでのキシラナーゼの改変

• 課題番号: 2004005385
• 研究機関名: 食品総合研究所
• 研究分担: 食品総合研究所 生物機能開発部 分子情報研究室
• 協力分担関係: 農業生物資源研究所
• 研究期間: 継続2001～2005
• 年度: 2004
• 摘要: 基質結合クレフトに障害物を作った変異体キシラナーゼを解析した結果、キシラナーゼはクレフトのマイナス側のサブサイトが、最初に基質と結合し、酵素反応が進行することを明らかにした。また、放線菌のキシラナーゼとオリゴ糖の結合構造を用いて、基質認識に関わるアミノ酸を特定した（図参照）。特に重要な機能を有すると考えられるアミノ酸を他のアミノ酸に置換した変異体酵素８種類を構築し、カイネティックパラメータを求めた。また、キシラナーゼの基質認識に関わる２７４番目を非天然アミノ酸に置換した酵素の中に天然型酵素より、若干高い活性を示すものが存在した。また、キシラナーゼの立体構造情報をもとにタンパクの環状化を行った。これらの酵素は全てキシラナーゼ活性を有していたが、熱安定性は天然型酵素と同様か若干低下していた。中温性菌であるCellvibrio gilvusのセロビオースホスホリラーゼ遺伝子前後のDNA配列をインバースPCR法により増幅した。得られた断片の配列を調べたところ、エピメラーゼと思われる遺伝子の一部を発見した。この遺伝子の並び方はVibrio属細菌のキトビオースホスホリラーゼ近傍と類似していた。