チューリップに発生する２種類のポティウィルスのＲＴ−ＰＣＲ法による同時検出技術

• 担当機関: 富山県農業技術センタ－
• 研究期間: 1998～1998
• 発行年度: 1998
• 要約: RT-PCR法を利用して、設計したプライマーによってチューリップがＴＢＶ（チューリップモザイクウイルス）とＴＢＶユリ系のどちらかに感染しているかを診断できる。本プライマーを用いるとＴＢＶとＴＢＶユリ系を同時検出することができ、本法でユリからも検出可能である。
• 背景・ねらい: 従来、チューリップからのウイルス検出は抗血清を用いるELISA法などによることが多かったが、これには抗血清精製の作業を必要とし、非特異反応が起こることも多い。また、２種類のウイルスを検出するには２種類の抗血清が必要である。そこで、簡便かつ高感度で非特異反応の少ないチューリップモザイク病の診断法としてＰＣＲ法を利用した同時検出法を開発する。

成果の内容・特徴

1. 逆転写反応　ウイルス粗汁液
   (RT)反応用バッファー 30℃・30分間→42℃・15分間→
   dNTP(５μmol)95℃・５分→４℃・５分間の順で行う。
   逆転写用プライマー(50pg)
   逆転写酵素(100U)
   PCRの条件上記反応液 95℃・１分
   上流用プライマー(50pg)　 55℃・２分33回繰り返す
   Taqポリメラーゼ（１Ｕ）　72℃・２分
   プライマーは逆転写・リバースプライマーとしてN819b 、フォーワードプライマーとして B1、N310fの３種類（図１）で、B1-N819b組み合わせによりＴＢＶユリ系が約370bpの大きさのバンドとして検出され、N310f-N819bの組み合わせによりＴＢＶが約500bpバンドとして検出される（図２レーン13、14）。また、上流用プライマーB1とN310fを同時に加え、PCRを行うことにより、ＴＢＶとＴＢＶユリ系の同時検出が可能である（図２レーン３）。
   
2. チューリップの葉、球根、花弁の粗汁液（葉と等量の0.1Ｍトリス-チオグリコール酸（pH9.0）で抽出）から検出可能で、ウイルス純化・除タンパクなどの前処理を必要とせず作業が簡便である。
   
3. このRT-PCR法を用い自然発病株５５株からの検出診断を行った結果、混合感染株が３株、ＴＢＶユリ系のみに感染している株は１株あった（図２）。
   
4. 本法はユリからもウイルス検出が可能である（図３）。
   

成果の活用面・留意点

1. 本検出法は高感度なので、弱毒ウイルスの選抜、増殖に使用するウイルスフリー株の検定と弱毒ウイルス感染の有無、またウイルスの増殖程度を生育の初期段階（ウイルスの増殖量が少ない段階）で検出できる。
   
2. 東北農業試験場と共同で特許出願中。出願番号は平成１０年特許願第289687号
   

• カテゴリ: チューリップ ゆり