ガラス化保存牛胚の融解後のストロー内希釈・直接移植法

• 担当機関: 群馬県畜産試験場
• 研究期間: 1998～1999
• 発行年度: 1999
• 要約: 7～8日齢の黒毛和種胚をガラス化保存した。融解後、ストロー内においてエチレングリコール+ショ糖液によって一段階希釈後、直接移植した。その結果、50.7%の受胎率が得られ、対照区の10%エチレングリコールを用いて緩慢凍結した牛胚の直接移植の成績（50.0%）と同様であった。
• 背景・ねらい: ガラス化保存法は、室温で高濃度の耐凍剤を用いて、胚細胞内水の脱水を促しながら、液体窒素ガス中での急速冷却によって胚をガラス化して、液体窒素中に保存する方法である。本法には胚専用凍結機器は不要であり、また、1胚あたり数分の所用時間で保存が終了する利便性がある。よって、適正な融解法を備えたガラス化保存法の確立は、牛胚保存法の簡易化をもたらすものと期待される。本試験では、融解後のガラス化胚の耐凍剤希釈をストロー内に充填したエチレングリコール+ショ糖液によって一段階的に実施し、直接移植による受胎性から本法の有効性を調べた。

成果の内容・特徴

1. 供試胚には黒毛和種牛に過剰排卵誘起処置・人工授精を行い、発情後7～8日目（発情日=0日）に回収した形態評価がA・Bランクの胚を用いた。
   
2. ガラス化保存は石森ら（1992）の方法に準じ実施した。胚を50%濃度のVSED（25%エチレングリコール,25%ジメチルスルフォキシド/4mg/mlBSA加D-PBS）に50～60秒間浸漬した。次に、VSED(100%濃度)に浸漬し、直ちに、図1のストロー内溶液構成になるように胚をVSEDと共にストローに吸引・閉封し（VSED浸漬からストロー閉封まで約40秒）、液体窒素ガス内（-160℃）に2分間静置後、液体窒素中に保存した。これらの操作は全て室温下で実施した。
   
3. 加温融解は、ストローの空中保持（ 8～10秒）と水中浸漬（20～22℃,約10秒）で行い、希釈はストローを数回振り下ろすことによって各液層を混合した。ついで、ストローを再度水中に 5分間垂直（綿栓部下）保持後、胚は再封入せず移植した。対照区には凍結媒液に10%エチレングリコール+0.1Mショ糖を用いた緩速凍結・直接移植法を採用した。
   
4. 妊娠鑑定は移植後35～50日に直腸検査法により実施した。
   
5. ガラス化胚の移植後の受胎率は 50.7%（105/207）で緩速凍結胚（50.0%,57/114）と同等であった（表1）。また、ステージ別にも有意な差はなく（表2）、本法には実用性があると判断された。
   

成果の活用面・留意点

1. 胚専用凍結機器を持たなくても胚の保存が可能である。
   
2. 移植現場での加温融解が可能。
   
3. 低ランク胚についての検討を要す。