コムギ縞萎縮病ウイルスのRT-LAMP法を用いた高感度な検出

• 担当機関: 三重科技セ
• 研究期間: 2005～2007
• 研究担当者: 鈴木啓史; 黒田克利
• 発行年度: 2007
• 要約: RT-LAMP法を用いることで、コムギ縞萎縮病ウイルスを高感度に検出できる。この方法は、DAS-ELISA法と比較し1,000倍検出感度が高い。
• キーワード: コムギ、縞萎縮病、ウイルス検出、RT-LAMP法
• 背景・ねらい: コムギ縞萎縮病は、土壌微生物媒介性のウイルス病害である。コムギの栽培面積の増加とともに、本病害の発生面積も増加し問題となっている。現在、コムギ縞萎縮病ウイルスの検出には、DAS-ELISA法やRT-PCR法による検出法が開発されているが、より簡易に短時間で検出できるように、RT-LAMP法による検出法を開発する。
• 成果の内容・特徴: １．; RT-LAMP反応は、増幅対象領域をはさむ6ヶ所の塩基配列をもとに設計した4種類のプライマーセット（表１）、およびRNA増幅試薬キット（栄研化学株式会社）を用いる。; ２．; RT-LAMP法は、コムギ葉0.04ｇ（約20mm×5mm）を、緩衝液（NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄・12H₂O 2.9g、KH₂PO₄ 0.2g、DW 1000ml、Tween20 0.5ml、pH7.4）100μlで磨砕後、緩衝液700μｌ追加（原体×20）したものをそのまま反応に用いることができるため、コムギから遺伝子の抽出・精製を行う必要がなくPCR法より簡易である。; ３．; RT-LAMP反応により遺伝子が増幅すると、蛍光・目視検出試薬により蛍光発色するので、60分後にチューブを目視するだけで判定できる（図１）。; ４．; RT-LAMP法の検出感度は、DAS-ELISA法と比較し1,000倍高い（図２）。; ５．; 6葉期から出穂期頃に採取したコムギ葉95検体（13市町、10品種）の最上位葉から第2葉または止め葉を用いて、DAS-ELISA法とRT-LAMP法による検出比較を行った結果、DAS-ELISA法が陽性（43件）でRT-LAMP法も陽性になったのは、90.7%（39件）でほぼ一致する（表２）。
• 成果の活用面・留意点: １．; コムギ縞萎縮病ウイルスを検出することにより、適切な被害軽減対策を講じることができる。; ２．; RT-LAMP反応はきわめて検出感度が高いので、試料、反応液の調製に当たってはコンタミネーションの無いように注意する。また、反応液の調製は氷上で行う。; ３．; RT-LAMP反応時間は60分とする。60分を超えると非特異反応が起こることがある。; ４．; RT-LAMP法を用いた検出を研究目的以外で行う場合は、栄研化学株式会社に対し、RT-LAMP法に関する特許の実施許諾契約が必要となる。
• カテゴリ: 萎縮病 品種