PEP-PCRを利用したウシ体外受精初期胚の１〜２割球を用いた性判定

• 担当機関: 兵庫農総セ
• 研究期間: 2000～2005
• 研究担当者: 冨永敬一郎; 大塚由佳子
• 発行年度: 2002
• 要約: ウシ体外受精に由来する8～16細胞期胚の1～2割球を用いて性判定する場合に、PEP-PCR後にPCR産物を精製し、性判定プライマーでPCRすると、実用レベルで利用できる高い性判定率が得られる。
• キーワード: ウシ体外受精胚、性判定、8～16細胞期、PEP-PCR、PCR産物の精製
• 背景・ねらい: ウシ胚を用いた性判定等の実用的なDNA診断で、再現性のある結果を得るためには、5～8細胞が必要であると言われているが、細胞数の少ない初期胚の一部割球を用いて各種DNA診断が可能になれば、早期に診断結果が得られ、胚の利用性は高まる。; そこで、1～2割球による診断を可能とするために、最初にPrimer Extension Preamplification (PEP) - PCR法 (Chreneket al., 2001)でゲノム全領域を増幅し、次に、性判定プライマーを用いてPCRを行う方法を検討するとともに、PEP-PCRで増幅したPCR産物の精製を試みて、判定結果に及ぼす効果をみる。
• 成果の内容・特徴: 1.; サンプル割球を3mg/ml PVP加TCM199液で3回洗浄後0.5ml DNA-RNAフリー水に入れ、10μlの水と共に8連PCRチューブに入れる。; 2.; 96℃5分間でDNAを抽出後、図1に示した15merランダムプライマー(OPERON)を用いたPCRの条件でPEP-PCRを行う。; 3.; PCR産物の精製にはSUPREC-PCR (TAKARA)を用い、カラムに25μlのPCR産物と400μlの水を加え1,000 x ｇ、15分間で遠心後、カラムを逆さにし、カラム内部を15μlの水で洗浄し、5分間の遠心によって、DNAを含む水をPCRチューブに回収する。; 4.; 性判定プライマーとしてBY/ BSP (Kovar and Rickord, 1996)を用いた場合、PEP-PCR後にPCR産物を精製することにより雄バンドのみでなく雌雄共通バンドも鮮明になり(図2)、性判定率が向上した ; (無精製: 32.0%, 16/50、精製: 88.8%, 48/54, P＜0.05)。; 5.; サンプル割球と発生した胚盤胞との性判定成績はすべて一致した(26/26)(図3)。; 6.; 同一サンプルに対して2種類の性判定(BY/BSPプライマーとXYセレクター)を用いて検査した結果、両者の成績は一致し(図4)、併用することにより性判定率は96.3%(52/54)まで向上した。; 7.; ウシ体外受精8～16細胞期胚のサンプル割球として1～2細胞を用い、PEP-PCRして、性判定PCRを行う場合に、PEP-PCR後にPCR産物を精製することにより、性判定率が実用レベルまで向上する。
• 成果の活用面・留意点: 1.; ウシ体外受精胚の性判定に用いる。; 2.; 受精卵核移植におけるドナー割球の性判定に用いる。