金属プロテアーゼ遺伝子を有する土壌細菌の選択的検出法の開発

• 担当機関: 九州農業試験場
• 研究期間: 1995～1995
• 発行年度: 1995
• 要約: Serratia marcescensの菌体外プロテアーゼ遺伝子構造を基に作成したＤＮＡプライマーとＤＮＡプローブにより、土壌中の金属プロテアーゼ遺伝子を有する微生物を培養せずに直接選択的に検出することができる。
• 背景・ねらい: 土壌微生物の生態を調べるのによく用いられてきた希釈平板法には、培養できない微生物の影響を評価できないという欠点がある。また、特定の土壌微生物を検出するのに適した選択培地を開発するのは容易ではない。ここでは、土壌中の物質循環の基本となる土壌プロテアーゼの供給源として重要な金属プロテアーゼを有する特定の土壌微生物を選択的に検出するために、金属プロテアーゼ遺伝子の塩基配列に基づいた検出手法を開発する。

成果の内容・特徴

1. 家畜スタリーを施用した土壌から、主要なプロテアーゼ生産菌として S.marcescenｓ(ｓ132株）を単離した。
   
2. ｓ132株が生産するプロテアーゼの酵素特性・Ｎ末端アミノ酸配列は既知の金属プロテアーゼであるセラチオペプチダーゼと一致していた。
   
3. 合成ＤＮＡプライマー（ＳＲ10、ＳＦ5）を用いて、ｓ132株の全ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応により、セラチオペプチダーゼと高い相同性があるＤＮＡ（1.68Ｋｂ）を増幅することができた（図１）。
   
4. 増幅したＤＮＡをジゴキシゲニンでラベルすることにより、ＤＮＡプローブを作成した。
   
5. ＳＲ10及びＳＦ5を用いて、プロテアーゼを生産する各種細菌を全ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応の結果 S.marcescens(ｓ112、ｓ131株)及びグラム陰性細菌（ｍ110株)の持つ金属プロテアーゼ遺伝子のみが増幅された（表１）。
   
6. 既知量のｓ132株を加えた殺菌土壌から直接抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡプローブを用いて金属プロテアーゼ遺伝子を検出した結果、検出限界は100ＣＦＵ／グラム乾土である（図２）。
   

成果の活用面・留意点

1. 非殺菌土壌の場合には、ＤＮＡプローブと反応する低分子のバンドが現れるが、金属プロテアーゼの検出には影響しない（図２、レーン２）。
   
2. 多量の腐植を含む火山灰土壌に適応するためには抽出条件の検討が必要である。