プロテアーゼ生産性Bacillus属細菌の16S rDNAの制限酵素切断部位に基づく同定

• 担当機関: 九州農業試験場
• 研究期間: 1997～1998
• 発行年度: 1997
• 要約: ユニバーサルプライマーで増幅した16S rDNAの制限酵素切断部位（Hae III ，Cfo I ，Alu I ）の相違により，耕地土壌から分離したプロテアーゼ生産性のBacillus 細菌は種或いは近縁種のレベルで同定できる。
• 背景・ねらい: 現在まで土壌の物質循環と微生物生態との関係解明を目的として，土壌プロテアーゼの生産に重要な役割を果たす多数のBacillus 属細菌を分離してきている。近年Bacillus 属細菌の分類は16S rDNAの可変領域の塩基配列により見直されてきている。よって，この領域の相違を反映する制限酵素切断部位を検索し，これらの制限酵素切断部位の相違に基づいたプロテアーゼ生産性のBacillus 属細菌の同定手法を開発する。

成果の内容・特徴

1. データベースに登録されている16S rDNAの塩基配列から推定したBacillus属細菌（19種；31株）は制限酵素切断部位（HaeIII ，CfoI ，AluI ）の相違により，16グループに分類できる（図１）。
   
2. ユニバーサルプライマーを用いて増幅した対照菌株（９株）と，水田土壌から分離したプロテアーゼ生産性のBacillus 属細菌（12株）の16S rDNA（22-1085bp）を，制限酵素で切断し，デンシトグラムで求めた断片長をもとに推定した切断部位は，データベースから推定した切断部位とほぼ一致した（表１)。そこでこの手法は同定手法として利用できる。
   
3. この手法によって新たに畑土壌から分離したプロテアーゼ生産性のBacillus属細菌（11株）は制限酵素切断部位から，B. subtilis グループ（U80：②*），B. cereus グループ（N4，N3，N7，N9，N68，U44，U72：⑨，⑨**），B. sphaericus （N63，N80，U77：⑭***）と同定され（表１)，結果は簡単な生理試験による結果と一致した。
   　以上の結果から16S rDNAの制限酵素切断パターンによる分類はBacillus 属細菌の簡易な同定手法として有効である。
   

成果の活用面・留意点

1. 土壌から分離したBacillus 属細菌のみではなく，形態学的グループ１群及び３群に属する一般的なBacillus 属細菌の分類／同定にも適用できる。
   
2. 類縁種であるB. subtilis グループ，B. cereus グループ内の分類は本法ではできない。
   
3. デンシトグラムで求めた切断長から推定した切断部位はデータベースから決定した切断部位と１，２箇所のAlu I 部位の違いが見られる場合がある。
   

• カテゴリ: 水田 データベース