牛及び豚GM-CSF遺伝子のクローニングとバキュロウイルス発現系による組換え型GM

• 担当機関: 家畜衛生試験場
• 研究期間: 1994～1997
• 発行年度: 1995
• 要約: 食菌・殺菌作用を担う細胞を活性化するGM-CSFのcDNAを牛及び豚のＴ細胞 のＲＮＡを用いたRT-PCRでクローニングし、バキュロウイルス遺伝子発現系に組み込んで生物 活性の有る組換え型GM-CSFを効率よく生産した。これによって動物への接種実験が可能になっ た。
• 背景・ねらい: 複合感染病、日和見感染病、子豚や子牛牛の下痢と肺炎、泌乳牛の乳房炎など免疫調節能力の低下や免疫系の未発達が原因で起こる疾病による損耗を低減させるためにサイトカインを用いて免疫力を高め、あるいは適切な状態に維持することが期待される。しかし、それには質・量ともに充分なサイトカインを生産する必要がある。そこで、まず食菌・殺菌作用を担う細胞を活性化する顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）の遺伝子を牛及び豚からクローニングし、バキュロウイルス遺伝子発現系を用いて組換え型ＧＭ－ＣＳＦを生産した。

成果の内容・特徴

1. 牛及び豚ＧＭ－ＣＳＦのｃＤＮＡクローニング
   牛ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子の塩基配列は既に報告されていたのでこれに従ってプライマーを合成し、ヒトヘマグルチニンＰなどで刺激した牛Ｔ細胞株Ｔｈ６のＲＮＡを用いたＲＴ－ＰＣＲ法で分泌シグナルを含むＧＭ－ＣＳＦ前駆体のｃＤＮＡを増幅し、プラスミドにクローニングした。また豚ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子の塩基配列は報告されていなかったので、ヒトヘマグルチニンＰなどで刺激したブタヘルパーＴ細胞株ＰＰ２５のＲＮＡを用い、牛ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子配列をもとにして設計したプライマーでＲＴ－ＰＣＲを行った。この産物をプラスミドに挿入してライブラリーを作り、牛ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子をプローブとしたコロニーおよびサザンブロットハイブリダイゼーションを行って目的のクローンを選択し、塩基配列を決定した(図１）。
   
2. 組換え型ＧＭ－ＣＳＦの生産
   牛及び豚のＧＭ－ＣＳＦ前駆体のｃＤＮＡを組み込んだ遺伝子組換えバキュロウイルスを作出し、昆虫由来の細胞株Ｔｎ５に感染させて無血清培地で培養したところ、牛ＧＭ－ＣＳＦでは培養上清中に主に分子量約20kDaの組換え型ＧＭ－ＣＳＦが多量に蓄積し、１７ｋＤａのタンパク質も観察された（図２）。また豚ＧＭ－ＣＳＦでは分子量約２１ｋＤａのタンパク質が蓄積した。これらの発現産物のＮ－末端アミノ酸配列から、天然のものと同じ位置でシグナルペプチドが切断されていることがわかった（図３）。またその発現量は、牛ＧＭ－ＣＳＦが１００～２００ｍｇ／Ｌ、豚ＧＭ－ＣＳＦが約２０ｍｇ／Ｌだった。これらの組換え型ＧＭ－ＣＳＦはどちらも骨髄細 胞などの分化、増殖を誘導するなどの生物活性を示した（図４）。
   

成果の活用面・留意点

バキュロウイルス遺伝子発現系を用いて効率よく生物活性のある組換え型ＧＭ－ＣＳＦを生産することが可能になった。これによって牛あるいは豚を用いた動物実験が出来るようになった。今後生物活性の解析を進めると共に、大量かつ低コストで生産出来る手法の開発が必要である。

• カテゴリ: 低コスト 乳牛 豚