サイトカイン遺伝子の簡易迅速合成法（ＳＰＲ法）の開発

• 担当機関: 家畜衛生試験場
• 研究期間: 1997～2002
• 発行年度: 1999
• 要約: 人工遺伝子を簡便かつ迅速に作製する手法としてＳＰＲ法（Self Polymerase Reactionを開発し，ウマインターフェロンα１及びγ遺伝子を作製した。
• 要約(英語): In spite of many advantages, artificial genes for cytokines have seldom been prepared due to the difficulty of constructing long genes from short DNA oligomers. To improve the method for the construction of a cytokine gene, a new way to construct a long gene easily and rapidly was developed. Using a plus gene and a minus gene both as template and primer that have 20～40 bases of cohesive ends, a double stranded DNA is synthesized by the reaction of polymerase. We named that as the SPR method.; First, the gene sequences of equine interferon alpha-1 and gamma were designed with consideration of the creation of a restriction site and the adaptation to yeast codon usage. Then, 8～11 of the DNA short oligomers (each is 80 mer～93 mer) containing plus genes and minus genes, were synthesized by a DNA synthesizer. Each set of plus and minus genes was mixed and reacted with rTaq DNA polymerase. Then, similar reactions were repeated with the sets of these products. The final product was about 600 bp in length, which indicated that the full-length gene should be prepared. As the result of DNA sequencing, it was shown that this artificial gene had a complete sequence of equine interferon alpha-1 and gamma.; Within only a week, about 600 bp of the artificial genes were easily, rapidly and completely constructed. More than 1,000 bp of gene or genome can be prepared using the SPR method. (Lab. of Epizootiology, Department of Exotic Diseases TEL [phone]); References:; CYTOKINE, 11 : p.927 (1999)
• 背景・ねらい: 人工遺伝子は野生型遺伝子に比べて，発現した時の組換え型蛋白質の生産量が多く，制限酵素切断部位を自由に設定できるなど，数々の利点を有している。また人工遺伝子は，ハイブリッド蛋白質など自然界に存在しない未知の有用物質を作製するための唯一の方法でもある。しかし作業工程が煩雑で難しく，完成までに長期間を要することから，未だ作製されている例は多くない。そこで本研究では，２本のＤＮＡが互いを鋳型として複製して，完全な２本鎖ＤＮＡになる現象に着目し，これを利用してサイトカイン遺伝子を人工合成することを試みた。

成果の内容・特徴

1. ＳＰＲ（Self Polymerase Reaction）とは，末端部の数１０塩基が相補するプラス鎖とマイナス鎖の１本鎖ＤＮＡを用いて，各々を鋳型兼プライマーとして酵素（Polymerase）反応させ，完全な２本鎖ＤＮＡにする方法である。図１にＳＰＲ法と従来法で，同じ長さの遺伝子を合成する場合の実験操作の比較を示す。ＳＰＲ法では作業行程が大幅に簡略化されており，従来法で数週間かかる実験作業がわずか数時間に短縮された。
   
2. ウマインターフェロンα１及びγのアミノ酸配列を元に，酵母や昆虫細胞における至適コドンに適合し，制限酵素切断部位を設定した遺伝子を設計した。末端部が20から40base相補するように80merから99merのプラス鎖とマイナス鎖を設定し，各々をＤＮＡ合成機で合成して，電気泳動で精製した。これらを等モルずつ図２に示すような行程でＳＰＲを繰り返し，人工遺伝子を作製した。pUC19にクローニングし，塩基配列を解析したところ，ウマインターフェロンα１及びγの完全な塩基配列を有する人工遺伝子が作製されていた。
   
3. 従来法では人工遺伝子の作製に数ヶ月から数年という長期間を要した上に，欠失変異が遺伝子中に入るなど問題が多かったが，ＳＰＲ法では１週間以内で遺伝子が完成し，変異の挿入も少なかった（表１参照）。
   

成果の活用面・留意点

　 サイトカイン人工遺伝子を簡便・迅速に作製するための新しい手法としてＳＰＲ法が開発された。インターフェロンなどに限らず，様々な有用遺伝子の作製が可能，さらに本方法は遺伝子改変による蛋白質工学や人工蛋白質の設計にも応用可能である。また大きな遺伝子・ゲノムの人工的合成への応用も可能と考えられる。

• カテゴリ: ICT 馬