液体培養とリアルタイムPCRを組み合わせたヨーネ菌培養検査法

• 担当機関: （独）農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究所
• 研究期間: 2006～2008
• 研究担当者: 森 康行; 永田礼子; 吉原一浩
• 発行年度: 2008
• 要約: 液体培地を用いてヨーネ菌を培養することにより、ヨーネ菌の分離率が高まり、培養液中のヨーネ菌DNA量をリアルタイムPCRで定量することにより、培養開始後2週間という短時間でヨーネ菌の増殖を検出することが可能である。
• キーワード: ヨーネ病、ヨーネ菌、液体培地、リアルタイムPCR、培養検査
• 背景・ねらい: ヨーネ病は我が国で最も多発している牛の法定伝染病の一つであり、診断・淘汰により防疫が進められているが、発生数の減少をみるには至っていない。ヨーネ菌の培養検査はヨーネ病の重要な診断法であるが、固形培地上ではヨーネ菌の発育が極めて遅い為、結果を得るまでに2～5ヶ月を必要とする。そこで、米国民間メーカーが開発したヨーネ菌用液体培地を利用したヨーネ菌培養とリアルタイムPCRによるヨーネ菌DNA定量法を組み合わせ、迅速なヨーネ菌培養検査法（液体培養・リアルタイムPCR検査法）の確立を目指す。

成果の内容・特徴

1. 液体培地中のヨーネ菌は速やかに増殖し、そのDNA量は培養2週間後には培養開始時点と比較して、10～100倍に達する（図1）。
2. 培養用糞便サンプルの前処理法として、メーカーの推奨法、従来のヘキサデシルピリジニウムクロライド（HPC）処理後にバンコマイシン、ナリジクス酸、アンホテリシンＢの混合液（VNA）処理を行う二重抗菌剤処理法（HPC-24h+VNA）（Stabel, J. Vet. Diagn. Invest. 9:375-380, 1997）、およびHPC処理を4時間とした短時間処理法（HPC-4h+VNA）を比較したところ、3者の処理方法の違いによるヨーネ菌増殖への影響は認められず（図1）、HPC短時間処理法が簡便な処理方法として推奨される。
3. 液体培養・リアルタイムPCR検査法は初代培養検査において、寒天培養法より高い検出率を示す（表1）。

成果の活用面・留意点

1. 寒天培地を用いるヨーネ菌分離培養法に比べ、検出感度が高くかつ検査期間の短縮が可能な液体培養・リアルタイムPCR検査法は、実用的なヨーネ菌培養検査法として野外への普及が期待される。
2. 液体培養・リアルタイムPCR検査法は、ヨーネ菌培養成績と糞便中等のヨーネ菌DNAを直接検出する遺伝子検査成績を比較する上でも有用である。
3. 液体培地からのヨーネ菌DNAの抽出・精製が煩雑であるため、簡便かつ効率的なDNA抽出方法の開発が重要である。