乳酸菌グルタミン酸脱炭酸酵素の新規精製法

• 担当機関: 畜産試験場
• 研究期間: 1995～1995
• 発行年度: 1995
• 要約: Ｌactococcus lactis産生するグルタミン酸脱炭酸酵素(GAD)の精製を妨害するタンパク質に対するモノクローナル抗体を作製した。この抗体を利用したアフィニティークロマトグラフィによりＧＡＤの簡便な精製法を確立した。
• 背景・ねらい: γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、タンパク質が分解してできるアミノ酸の１種であり、血圧降下作用などの機能性が注目されている。チーズでは、熟成中に雑菌によって生成することが多いため、製品には含まれないことが望ましいとされている。しかし、正常な熟成をしたチーズにもＧＡＢＡが確認され、スターター乳酸菌のグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）により生じると考察される。チーズ中での乳酸菌によるＧＡＢＡは生成を明らかにするには、乳酸菌ＧＡＤを単離し、作用特性を解明することが必要である。これまで乳酸菌ＧＡＤの単離精製を試みたが、夾雑するタンパク質を完全に除くことはできなかった。そこで、本研究では、ＧＡＤに対するモノクローナル抗体を作成し、ＧＡＤの高度精製法を確立することを目的とした。

成果の内容・特徴

1. 　Ｌactococcus lactis 01-7株の菌体抽出液より硫安塩析・疎水クロマト・イオン交換・ゲルろ過クロマトグラフィーにより精製したＧＡＤの部分精製標品を抗原として、モノクローナル抗体を作製した。
   
2. 　抗原には陽性なクローン10株（ＩgＧ1が３クローン、ＩgＧb2が１クローン、ＩgＭが６クローン）は、ウェスタンブロッティングの結果、いずれも抗ＧＡＤ抗体ではなく、これまでＧＡＤから分離することができなっかた夾雑タンパク質に対する抗体を産生していた（図1）。
   
3. 　夾雑タンパク質に対するモノクローナル抗体Ｍ３-Ａ（サブクラスＩgＧ１）を用いてアフィニティーカラムを作製し、ＧＡＤの精製に供した（図２）。
   
4. 　ＧＡＤ活性は作製したアフィニティーカラムに吸着されたが、0.35Ｍ NaＣ１の画分に溶出された。一方、精製の障害であった夾雑タンパク質は0.30Ｍ ＮaＣ１画分に溶出され、ＧＡＤと分離することができた（図3）
5. このＧＡＤ活性画分をウルトラフリー30で円心濃縮後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ゲルを２mm幅で切り出し、ＧＡＤ活性を測定した（図4）。この結果ＧＡＤ活性と一致する位置に単一なバンドを得ることができた。
   

成果の活用面・留意点

1. 作製したアフィニティーカラムを用いて夾雑タンパク質を取り除くことにより、これまでの精製方法に比べ乳酸菌ＧＡＤを簡便に精製することが可能となる。
   
2. 電気泳動法によりＧＡＤが単一なバンドとして得られる。
   

• カテゴリ: 機能性