ＰＣＲ法を用いたＤＮＡ多形連鎖地図の作成とＳＴＳ化

• 担当機関: 農業生物資源研究所
• 研究期間: 1994～1994
• 発行年度: 1994
• 要約: RAPD法を用いてイネのDNA多型連鎖地図を作成する手法を確立した。さらに、標的領域の遺伝子型でＦ2分離個体をグループ分けし、それぞれのDNAを混合して、標的領域に集中的にマーカーを設定するバルク法を確立した。
• 背景・ねらい: 有用な農業形質遺伝子を単離するためには、詳細な連鎖地図を作成し、有用遺伝子の位置を把握することが必要である。これまで制限酵素断片長多型（RFLP）を用いた連鎖地図作成の努力がなされてきたが、単一の多型検出法ではマーカーの分布が片寄る傾向にあることがわかってきた。そこで、任意増幅多型DNA（RAPD）法を用いた新しい多型検出手法でマーカー分布を均一化するとともに、着目した領域に集中的にマーカーを設定する手法の開発を目指した。

成果の内容・特徴

1. 　連鎖解析を行う材料として、日本晴（日本稲）とカサラス（インド稲）及び、186個体のＦ2個体のDNAを用いた。80種類の10塩基の無作為に選んだ塩基配列を持つプライマーを用いてDNA合成酵素連鎖反応（PCR）を行い、RAPDを検出した。検出した多型データを連鎖解析ソフトMAPMAKERを用いて解析し、連鎖地図を作成した。
   
2. 　さらに、第６染色体中流領域の２つのマーカーを選んで、その領域で日本晴あるいはカサラスの遺伝子型を示すＦ2DNAを10個体程度選抜して混合して、日本晴バルクDNAとカサラスバルクDNAを作成してRAPDによる多型検出を行った。ほとんどの多型断片が２つのマーカーの間にマップされるとの予想どおり、15マーカーが目的の領域にマップされた。
   
3. 　マップされた多型断片を、プラスミドベクターpBluescriptSK＋にクローン化し、塩基配列を決定して塩基配列標識部位（STS）化を行った。
   

• 成果の活用面・留意点: RAPD法は、RFLP法に比べて操作が容易で、また、特別な設備を必要としないので、得られたRAPDマーカーの育種選抜の現場での応用が可能である。ただし、今回検出した多型は、日本晴とカサラスの間での多型であるので、実際の選抜に用いる交配集団では多型が検出されない場合もある。バルク法に関しては、高精度の連鎖地図がない場合でも、Ｆ2DNAを表現型でグループ分けすることで目的の表現形質マーカーの近傍にRAPDマーカーを設定することが可能なので、今後の応用が期待される。; 図１
• カテゴリ: 育種