単純反復配列マーカー開発法の効率化

• 担当機関: （独）農業・生物系特定産業技術研究機構 野菜茶業研究所
• 研究期間: 2002～2004
• 研究担当者: 河野いづみ(STAFF研究所); 宮武宏治; 大山暁男; 布目 司; 福岡浩之; 並木信和（STAFF研究所）
• 発行年度: 2004
• 要約: ゲノムＤＮＡから単純反復配列（SSR、マイクロサテライト）を選択的にクローニングしてライブラリーを構築する方法およびその塩基配列を自動処理してマーカー化のためのＰＣＲプライマーを設計するプログラムによって、単純反復配列を利用した効率的なＤＮＡマーカー作出ができる。
• キーワード: 単純反復配列、SSR、マイクロサテライト、濃縮ライブラリー、情報処理
• 背景・ねらい: 検出操作が簡便で対立遺伝子数が多く共優性に遺伝するという特徴をもつ単純反復配列(SSR)は各種野菜の汎用的なＤＮＡマーカー作出のために利用価値が高い。有用形質の遺伝解析やマーカー選抜法開発をはじめとするゲノム情報を利用した育種手法の高度化のためSSRを各種作物から効率的に単離しDNAマーカー化するための一連の技術を開発し、プロトコール化する。
• 成果の内容・特徴: 1.; SSRマーカー開発の流れは第１図に示す。ゲノムＤＮＡのうちSSRを含む断片をビオチン化プローブ(GA)nもしくは(GT)nに結合させて選択し、ベクターにクローニングして濃縮ライブラリーを作成する。その後、無作為に塩基配列決定を行いSSRを含む領域をSTS化する。; 2.; 断片化したゲノムＤＮＡへ付加するリンカーの配列の設計にあたり、付加反応時に生じる自己２量体を制限酵素XmnIで除去できるように工夫することによって、濃縮ライブラリー作成の際の反応の特異性と効率を著しく向上できる（図２）。; 3.; クローニングされたSSR領域を含むゲノム断片の塩基配列は市販のＤＮＡシーケンサによって決定する。ＤＮＡシーケンサからの出力ファイルを自動解析するために開発したプログラムread2Markerにより、SSR領域の検出、クローンの重複や多重遺伝子族と示唆されるものの排除などを自動的に行い、マーカー化のためのPCRプライマーが設計される（図３）。; 4.; ライブラリー構築は特殊な装置を必要とせず、プライマーの自動設計プログラムは一般の市販パーソナルコンピュータ上で動作する。
• 成果の活用面・留意点: 1.; この成果は、網羅的なゲノム情報に乏しい各種野菜の省力的かつ高精度なDNAマーカー開発に広く利用可能である。; 2.; 本手法はナス、ネギ、ヤマノイモでの実績があり、作物種は特に問わないと考えられる。; 3.; ライブラリー構築法の詳細なマニュアルおよびマーカー設計プログラムとドキュメントファイルはホームページ等で公開する予定である。
• カテゴリ: 育種 DNAマーカー なす ねぎ やまのいも