ブロッコリーベと病菌の分散媒使用による長期凍結保存法

• 担当機関: 野菜・茶業試験場
• 研究期間: 1992～1994
• 発行年度: 1994
• 要約: 人工培養できないブロッコリ－べと病菌の長期保存法を確立した。ブロッコリ－葉で増殖した分生胞子を10%dimethyl sulfoxide(DMSO)と5～10%スキムミルクを添加した水溶液で懸濁し、-20℃で１日予備凍結後、-80℃に移して保存する。
• 背景・ねらい: 純寄生菌のブロッコリ－べと病菌（Peronospora parasitica）の保存は、従来宿主の植物体を用いる継代培養に頼ってきた。この方法は継代の作業が煩雑であり、菌株間の相互汚染も懸念される。本菌の発生生態や系統分化等の研究を効率的に推進するためには、分生胞子による安定した長期保存法の確立が必要である。そこで、凍結保存時の傷害を防止する分散媒を用い、べと病菌の分生胞子の-80℃における安定な長期保存法を開発する。

成果の内容・特徴

1. 　凍結による傷害から分生胞子を保護する最も有効な分散媒は、分生胞子の発芽率からみてDMSOである。スキムミルクも保護効果が認められる（表１）。
   
2. 　分生胞子の発芽率は、-80℃の凍結処理によって著しく低下するが、-20℃で１日予備凍結後、試料を-80℃に移動することにより、発芽率は-20℃の凍結　処理と同程度に向上する。
   
3. 　複数添加の保護効果を比較するため、5%DMSOにそれぞれ5%スキムミルク、5%ブドウ糖或は1%グルタミン酸ナトリウムを添加した分生胞子懸濁液を-20℃に保存すると、DMSOとスキムミルク添加で分生胞子の発芽率は最も高く維持されるが、保存3か月後には発芽力を失う。
   
4. 　10%DMSOと5～10%スキムミルクの混合水溶液で懸濁した分生胞子を-20℃で１日間予備凍結後-80℃で保存すると、分生胞子は１年後でも保存直後と同程度の高い発芽率を維持し、ブロッコリ－子葉に対して強い病原性が認められる（表２）。
   

成果の活用面・留意点

1. 　凍結融解の繰り返しが病原性に及ぼす影響は未確認のため、試料は少量ずつ多数のチュ－ブに分注して保存し、融解した試料は再保存しない。
   
2. 　キャベツ、ダイコン及びハクサイべと病菌も同様の方法で保存可能である。
   
3. 　アブラナ科以外のべと病菌にも適用できる可能性がある。
   

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