繊毛虫検出用プライマーの作成及びそれを用いた繊毛虫の検出

• 担当機関: （独）農業・生物系特定産業技術研究機構 東北農業研究センター
• 研究期間: 2001～2005
• 研究担当者: 島野智之; 笠原康裕（茨城大学）; 村上敏文
• 発行年度: 2005
• 要約: 繊毛虫に特異的な塩基配列を明らかにしPCR増幅用プライマーを作成した。それを用いて、土壌など環境中のDNAを増幅することにより、繊毛虫の存在を検出できる。
• キーワード: 繊毛虫、プライマー、18SrRNA、PCR
• 背景・ねらい: 繊毛虫は、微生物の摂食者として生態系の物質循環に関与し、有機物の分解促進に大きな役割を果たしている。また、環境浄化指標微生物としても有望視されている。しかし、これまで土壌など環境中に存在する繊毛虫を簡便、迅速かつ確実に検出できる手法は報告されていない。そこで、繊毛虫に特異的な塩基配列を利用したPCR増幅のためのプライマーを作成し、環境中、特に土壌中に存在する繊毛虫の検出を試みる。
• 成果の内容・特徴: １. 土壌や水系などに生息する代表的な繊毛虫33種および他の原生動物等49種の18SｒRNA遺伝子の塩基配列をEMBL/Genebank/NCBIで検索、比較することにより、図１のように、繊毛虫において保存性が高い領域を見いだし、それに基づいて繊毛虫特異的プライマー(5'-GATGGTAGTGTATTGGAC）を作成し、CS322Fと名付けた。 ; ２. 土壌および培養系由来の5種類の繊毛虫を含む13種の生物のDNAを対象に、CS322Fおよび一般に知られている真核生物用のアンチセンスプライマー、EU929R（5’-TTGGCAAATGCTTTCGC）を用いてPCR増幅を行ったところ、目的の約600bpのバンドが、繊毛虫でのみ検出されたので、CS322Fの有効性が確認された（図2）。 ; ３. 土壌から抽出したDNAを対象にCS322FおよびEU9292Rのプライマーセットを用いてPCR増幅を行うと、約600bpの位置にバンドが確認され、繊毛虫の存在を検出できる（図3）。PCRは、プライマーセット、dNTPs、Taqポリメラーゼ、鋳型DNAを含むバッファーを94℃15秒、64℃15秒、72℃1分を1サイクルとして25サイクル行う。
• 成果の活用面・留意点: １. 本プライマーセットは、繊毛虫以外の生物DNAを増幅する可能性が全くないとはいいきれない。したがって厳密な検出を目的とする場合はシークエンス等を行って繊毛虫であることを確認する必要がある。 ; ２. 図3のバンドはクローニングを行い、繊毛虫の塩基配列であることを確認している（未発表データにつきデータは記載していない）。 ; ３. 土壌等の環境試料からのDNA 抽出は市販の抽出キットを用いる。