スクレイピー由来異常プリオンタンパク質の土壌からの高感度検出法

タイトル	スクレイピー由来異常プリオンタンパク質の土壌からの高感度検出法
担当機関	（独）農業・食品産業技術総合研究機構中央農業総合研究センター
研究期間	2003～2007
研究担当者	長岡一成吉岡都下嵜紀子山村友昭村山裕一横山隆毛利資郎
発行年度	2010
要約	Protein misfolding cyclic amplification(PMCA)を応用することにより、土壌中のスクレイピー由来異常プリオンタンパク質を抽出法よりも高感度に検出することができる。
キーワード	スクレイピー、Chandler株、異常プリオンタンパク質、PMCA、土壌
背景・ねらい	牛海綿状脳症(BSE)やヒツジのスクレイピー等、伝達性海綿状脳症(プリオン病)の感染性因子プリオンは、異常プリオンタンパク質(PrP^Sc)を主たる構成成分としている。スクレイピープリオンの感染性は土壌中で数年間残存することが知られており、土壌を介した水平感染の可能性を評価するためには、PrP^Scの土壌中での動態を解析する必要がある。しかしながら、これまで報告されている土壌からのPrP^Scの抽出方法等は、土壌中の微量のPrP^Scを検出するためには不十分である。 Protein misfolding cyclic amplification(PMCA)は、試験管内でPrP^Scを増幅する方法であり、通常のウェスタンブロットでは検出できないようなごく微量のPrP^Scを検出するために極めて有効である。ここでは、PMCAを応用して、土壌からスクレイピーPrP^Scを高感度に検出する方法を開発することを目的とする。
成果の内容・特徴	マウス順化スクレイピーChandler株を添加した土壌を懸濁し、反応液に添加してPMCA反応を行う。反応後のサンプル1/10量を植え継いでPMCAを繰り返し行う。PMCA産物をproteinase Kで消化した後、ウェスタンブロットでシグナルを検出する。 100μlの反応液に添加する土壌の量を少量にすることにより、1回のPMCAで高濃度の感染マウス脳を含むサンプルでPrP^Scの増幅が認められる。PMCAを繰り返し行うことにより、低濃度の感染マウス脳を含むサンプルでもPrP^Scが増幅される。一方、反応液に添加する土壌の量を増やすと、反応液に添加されるPrPScの量が増えるにも関わらず、増幅は認められない(図1)。抽出法によるPrP^Scの検出では、高濃度の感染マウス脳を添加した場合しかPrP^Scは検出されない。また、灰色低地土と淡色黒ボク土で検出感度が異なる(図2)。一方、PMCAの検出感度は土壌の種類の影響を受けにくく、抽出法と比較して灰色低地土の場合1000倍、淡色黒ボク土の場合10000倍高い(図3)。
成果の活用面・留意点	土壌中におけるPrP^Scの消長解析等に利用できる。全自動交差超音波蛋白質活性装置Elestein 070-GOT(エレコン科学)を用いてPMCAを行った結果である。他の動物種や株由来のPrP^Scの増幅のためには、新たな増幅条件の検討が必要である。
図表1
図表2
図表3
カテゴリ	肥料シカ羊