カンキツにおけるダイレクトPCR法

• 担当機関: （独）農業・食品産業技術総合研究機構 果樹研究所
• 研究期間: 2008～2012
• 研究担当者: 太田 智; 矢野加奈子; 栗田恭伸; 喜多正幸; 清水徳朗; 吉岡照高; 根角博久
• 発行年度: 2012
• 要約: カンキツの葉を突いた爪楊枝をPCR反応液に浸すことでダイレクトPCRを行うことができる。また、葉を突いた爪楊枝をTE0.2バッファーに浸すとDNAサンプルを作成することもできる。これにより、DNA抽出に要する時間、実験機器および消耗品類を大幅に削減できる。
• キーワード: カンキツ、DNAマーカー分析、ダイレクトPCR、DNA抽出、爪楊枝
• 背景・ねらい: 近年、カンキツ育種実生の早期選抜や品種識別のためにDNAマーカーを用いる機会が増えてきた。しかしながら、分析には多くの時間がかかり、高額な機器や試薬等の消耗品が必要であった。特に木本植物のDNA抽出においては、多糖類やポリフェノールなどのPCR阻害物質を取り除くために多くの工程が必要であった。そこで本研究では、カンキツにおけるダイレクトPCR法の開発に取り組んだ。

成果の内容・特徴

1. 緑化直後のカンキツ葉を爪楊枝で突き刺し、それをPCR反応液に浸すことによりダイレクトPCRを行うことができる(図1)。また、葉を突いた爪楊枝をTE0.2バッファー(10 mM Tris-HCl pH 8.0 and 0.2 mM EDTA)に浸すことでPCRが可能なDNAサンプルを作成することもできる(超簡易DNA抽出法とする)。いずれの場合も、純度の低いDNAサンプルからのPCR増幅が可能な遺伝子増幅用試薬を用いる。
2. ダイレクトPCR法および超簡易DNA抽出法によるPCRの成功率は平均96%である(表1)。
3. これにより95サンプルのPCRを開始するまでに要する時間を1.5～2時間(2006年成果情報;簡易で迅速なカンキツのDNAマーカー分析法、の10分の1以下)に短縮できる(図1)。また、サンプル破砕装置、遠心機、ヒートブロックなどの高額な実験機器が不要で、DNA抽出に用いる試薬やプラスチック製品などの消耗品も節約できる。

成果の活用面・留意点

1. 育種実生の早期選抜、苗木や穂木の品種判別に用いられている。
2. 1つのDNAマーカーについて素早く結果を得たい場合にはダイレクトPCRを、複数のDNAマーカーの場合には超簡易DNA抽出法を行うと効率が良い。
3. DNA抽出に向いた健全な葉であれば、成葉や旧葉も利用できる。
4. この方法により比較的長い500-1200bpのDNAマーカーの増幅が可能である。
5. サンプルの採取時期や実験条件の検討を行うことにより、カンキツ以外の木本植物(クリ、マンゴー、ナシなど)でも利用可能である。

• 研究内容: http://www.naro.affrc.go.jp/project/results/laboratory/fruit/2012/142c0_01_10.html
• カテゴリ: 育種 くり DNAマーカー 品種 マンゴー その他のかんきつ