カイコの糖鎖修飾関連酵素(グルコシダーゼII)の遺伝子単離と生産

• 担当機関: （独）農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究所
• 研究期間: 2007～2011
• 研究担当者: 渡邉聡子; 大田方人; 藤山和仁; 犬丸茂樹
• 発行年度: 2013
• 要約: 組換えタンパク質生産宿主であるカイコから、複合型糖鎖合成に重要な酵素の1つであるグルコシダーゼII(αおよびβサブユニット)遺伝子を単離する。両者の複合体発現により本来の基質となる糖鎖に対して高い活性を示す酵素が得られる。
• キーワード: カイコ、糖鎖修飾、組換え糖タンパク質、グルコシダーゼII
• 背景・ねらい: カイコを宿主とした組換えタンパク質生産システムは、生産量が高いことに加え付加される糖鎖が哺乳類に近いことからヒトや家畜などの糖タンパク質生産手段として有望である。哺乳類細胞ではグルコシダーゼII 活性が阻害されると付加される糖鎖が複合型からハイマンノース型へと変化するため、グルコシダーゼII が複合型糖鎖合成に重要な役割を果たしていることが知られている。より高機能な組換えタンパク質生産のためには糖鎖修飾関連酵素についての詳細を明らかにする必要があるが、カイコではそのほとんどが明らかにされておらず当該酵素も未解明である。そこで詳細な情報を得るため、当該酵素のαおよびβサブユニット遺伝子を単離し、遺伝子発現により本来の基質となる糖鎖に対して活性を有する組換えタンパク質を生産する。

成果の内容・特徴

1. カイコゲノムデータベース(KAIKObase)の相同性検索を行うことにより、ヒトと相同性が高いグルコシダーゼIIαサブユニット(BmGIIα)と、真核生物に共通のアミノ酸配列を有するグルコシダーゼIIβサブユニット(BmGIIβ)のcDNA を含む2つのプラスミドが見出される。
2. ヒスチジンタグを付加したBmGIIα(BmGIIα-His)、およびEGFP (Enhanced green fluorescence protein)を付加したBmGIIβ(BmGIIβ-EGFP)を発現する組換えバキュロウイルス(Vα、Vβ)をそれぞれ作製する(図1)。それぞれに付加したタグを指標に、VαとVβを共感染させた昆虫細胞(Sf21AE)の培養上清中におけるBmGIIαとBmGIIβの存在形態を解析すると、BmGIIαとBmGIIβの複合体が分泌されていることが証明される。
3. BmGIIαは単糖からなる人工基質(p-ニトロフェニル-α-D-グルコピラノシド)からグルコースを遊離する活性を示すが、本来の基質となる糖鎖(Glc₁Man₉GlcNAc₃)には活性 を示さない。しかし、BmGIIαとBmGIIβの複合体が形成されるGlc₁Man₉GlcNAc₃に対して高い活性を示す(図2)。

成果の活用面・留意点

1. 糖鎖を基質とするグルコシダーゼII複合体が可溶性タンパク質として得られ、糖鎖修飾に対する活性を解析することが可能になる。
2. カイコの餌である桑には1-デオキシノジリマイシンなどのグルコシダーゼII 活性を阻害する成分が高濃度に含まれているため、酵素活性に対する阻害成分の影響や基質特異性等を解析する必要がある。

• 研究内容: http://www.naro.affrc.go.jp/project/results/laboratory/niah/2013/niah13_s18.html
• カテゴリ: カイコ 桑 データベース