遺伝子組換えイネ検出のためのイネ種共通内在性配列の検討

• 担当機関: （独）農業・食品産業技術総合研究機構 食品総合研究所
• 研究期間: 2011～2014
• 研究担当者: 高畠令王奈; 真野潤一; 橘田和美
• 発行年度: 2014
• 要約: 新たに見出されたイネ内在性配列SPS2と既報のPLD2は、他の既報4種のイネ内在性配列に比べて、PCR反応効率、安定性、種得異性の面で優れている。GM検知に適したイネ内在性配列を見出すことにより、信頼性の高いGMイネ検知法の開発が可能となる。
• キーワード: 遺伝子組換え、検知、イネ、PCR、種特異的
• 背景・ねらい: 我が国のGM検知における標準分析法では、様々な作物種を対象に、PCR技術を利用した検出法が数多く利用されている。その際、各作物種に特異的な内在性配列は、定性分析法においては、検出系が正しく機能していることを確認するためのポジティブコントロールとして利用され、混入率を算出する定量分析法では、リアルタイムPCRのリファレンスとして利用されている。内在性配列の要件は、その作物種に固有であり、かつ、種間のゲノムにおいて安定した数で含まれることである。今後、開発途上国を含む多くの国や地域において、GMイネの開発および栽培が広がる可能性があるが、既報のイネ内在性配列には、PCRの反応効率や種特異性といった点に若干の問題があり、より優れたイネ内在性配列の開発が求められている。本研究では、既報の5種類のイネ内在性配列に加えて、Sucrose Phosphate Synthase (SPS)遺伝子のプローモーター領域に、新たなイネ特異的配列を見出し、それらのPCR反応性や種間における特異性を評価している。

成果の内容・特徴

1. 既報の5種類のイネ内在性配列(phospholipase D 遺伝子由来の2種類の配列:PLD1およびPLD2、SPS遺伝子由来の配列:SPS1、gos9遺伝子由来の配列:GOS9、およびppi-phosphofructokinase (ppi-PPF)遺伝子由来の配列:ppi-PPF)に加え、本研究で新たに設計したSPS遺伝子由来の配列:SPS2の合計6種類のシングルコピー配列に関して、リアルタイムPCR等を用い、反応効率、安定性、特異性等の性能比較が可能である。
2. ジャポニカ米、インディカ米を含む28品種のイネ種子を収集し、それぞれからDNAを抽出後、リアルタイムPCRで解析した結果から、SPS2はPCR反応効率を示すCt値が6種類中で最も小さく、反応効率の面で優れていることが示されている(表1)。
3. イネ28品種間での6配列のPCR反応の安定性を、F検定により比較している。品種間のばらつきは、PLD2、SPS2、PLD1、ppi-PPF、GOS9、SPS1の順に大きくなり、SPS1およびGOS9は他の配列に比べて有意にばらつきが大きく、残りの4種類の配列のうち、SPS2およびPLD2はさらにばらつきが小さいことが示されている(表2)。
4. SPS2の塩基配列は、解析に用いた28種類すべてのイネ品種において完全に保存されている(データは省略)。
5. イネ以外の作物(トウモロコシ、ダイズ、コムギ、オオムギ)およびイネ近縁種(アワ、ヒエ)から抽出したDNAを鋳型に定性的PCRを行う種特異性確認実験から、PLD1はイネ以外のイネ科作物においても増幅が見られるが、SPS2およびPLD2のPCR標的配列は、イネ特異的である(図1)。

成果の活用面・留意点

1. GMイネ検知法の内在性配列として、SPS2の標準分析法での利用を提案する。

• 研究内容: http://www.naro.affrc.go.jp/project/results/laboratory/nfri/2014/nfri14_s03.html
• カテゴリ: あわ 大豆 とうもろこし ひえ 品種