ファイトプラズマとキシレラのユニバーサル同時診断法

タイトル	ファイトプラズマとキシレラのユニバーサル同時診断法
担当機関	（国研）農業・食品産業技術総合研究機構果樹茶業研究部門
研究期間	2013～2017
研究担当者	伊藤隆男須崎浩一
発行年度	2017
要約	世界的に重要な植物病原細菌であるファイトプラズマとキシレラの全種・亜種の感染を、宿主植物を内在性コントロールとしてユニバーサルに同時診断する方法であり、多様な植物種を対象とし、両属細菌の感染と偽陰性の有無を短時間で判定可能である。
キーワード	ファイトプラズマ、キシレラ、植物検疫、ユニバーサル・マルチプレックスPCR、Dual priming oligonucleotide
背景・ねらい	ファイトプラズマ属('Candidatus Phytoplasma'spp.)とキシレラ属(Xylella spp.)細菌は多くの植物に感染し、生育不良や枯死などを引き起こす世界的な重要病原である(表1)。いずれも、近年の物流の活発化とともに発生地域を拡大し、世界各地で被害が深刻化しており、日本では多くが検疫有害動植物に指定されている。自国内への侵入を防ぐためには、植物検疫での正確な診断が不可欠であり、現場では多数の検体を扱うための簡易・迅速で高感度な検査手法が求められている。国際的な検査法として、PCRを利用した遺伝子診断法が用いられているが、両属細菌には多様な種や亜種があり、検定漏れや非特異反応の問題もある。果樹を中心に共通の宿主も多いため、多様な植物種から両属細菌を網羅的に同時検出できる手法を開発する。
成果の内容・特徴	本診断法は、Dual priming oligonucleotide(DPO)プライマー(標的遺伝子に対する認識部位をイノシンリンカー配列の前後に持つプライマー)をファイトプラズマ属とキシレラ属細菌を対象にそれぞれ作製し(表2)、属レベルの普遍性と特異性を両立させた新検査法である。両属細菌の既知の全ての種・亜種を網羅的に検出できる。また、それぞれの属内で保存性の高い遺伝子を標的としていることから、未知の種・亜種についても検出可能と考えられる。本検査法は、プローブ法による高感度なリアルタイムPCRにおいて、感度または特異性が既存の国際標準検査法よりも優れる(表3)。本法では、数細胞分に相当する精製DNA試料より、両属細菌を検出可能であり、ウイルス診断で使う簡易抽出核酸試料も利用できる。また、プライマーセットは、インターカレーター法によるリアルタイムPCRや通常のPCRにも利用でき、特に、キシレラでは既報よりも検出感度と特異性が優れている。両属細菌と宿主植物の3者を同時検出可能なリアルタイムPCRにも利用できる(図1)。多数(最大96)の抽出試料から、両属細菌の感染と偽陰性の有無の判定結果が50分間程度で得られ、労力・費用・時間が従来法の3分の1以下に抑えられる。 DPOプライマーを、プローブ法によるリアルタイムPCRに用いたのは世界初の試みである。ファイトプラズマとキシレラの同時診断は先例の無い技術であり、2種のキシレラについては、近縁細菌との非特異反応が無い唯一の診断法である。
成果の活用面・留意点	輸入時の種苗類の検査に用いることにより、国内未発生のファイトプラズマ・キシレラの侵入リスクの低減に貢献できる。 PCRの条件は、使用する機械や試薬により適宜変更を必要とする場合がある。ファイトプラズマでは、既存法と同様に、近縁細菌の一部が非特異的に検出されうるが(表3)、PCR産物の遺伝子型を判別することで確定診断を下すことが可能である。
研究内容	http://www.naro.affrc.go.jp/project/results/4th_laboratory/nifts/2017/nifts17_s23.html
カテゴリ	植物検疫