きのこの新育種技術の開発

• 課題番号: 2003004407
• 研究機関名: 森林総合研究所
• 研究分担: 森林総合研究所
• 研究期間: 継続2001～2005
• 年度: 2003
• 摘要: きのこ新育種技術の開発当年度の試験研究方法：シイタケの全DNAの調製は、CTAB法で行った。シイタケのSTSプライマーの作製は、平成14年度の報告書で示した方法で行った。ミトコンドリアDNAのリボゾームRNA遺伝子(rRNA)領域ののSTSプライマーは、遺伝子情報を基に設計した。続いて、合成したSTSプライマーと東洋紡のrTag DNA polymeraseを用いてPCR法で目的のDNA断片を増幅し、直接または、制限酵素で断片化後、ゲル電気泳動法で多型解析した。機能遺伝子のマッピングは、当該遺伝子の塩基配列情報を基にプライマーを設計し、そのプライマーで増幅されるDNA断片の挙動を100胞子から得た一次菌糸体とSSCP法を用いて解析した。続いて、機能遺伝子指標の分離比を算出し、連鎖地図上にマッピングした。LMOの構造解析は、定量PCR装置を用いて行った。その他の部分については、省略 当年度の研究成果：シイタケの品種判別用STSプライマー20組とmtDNAのrRNA遺伝子を指標とする簡易多型解析法を開発した。連鎖地図構築では、新たに４機能遺伝子を含む、100指標がマップできた。組換えきのこでは、遺伝型と表現型の解析並びに、組換え遺伝子の定量法を開発した。 1)ミトコンドリアDNAを指標とするシイタケの品種判別法として、mtDNAの大リボゾームRNA遺伝子領域のSTSプライマーによるPCR法、及び、その産物を４塩基認識制限酵素（Hha I、Msp I等）で断片化後、断片の多型解析を行うPCR-RFLP法を開発した。また、前年度から継続するシイタケ品種のDNAタイピング用STSプライマーの作製では、新たに、20組のプライマーを設計するとともに、新たにシイタケ市販品種62品種を加え合計155品種のRAPD指標のデータベースを構築した。2)シイタケの連鎖地図の作製では、新たに解析した4種類の機能遺伝子（LECAP,LERNR2,LEHYD1, LEHYD2)をすべて連鎖地図上にマッピングることができた。LECAPは第4連鎖群に、LEHYD1及びLERNR2は第11連鎖群に、LEHYD2は第16連鎖群に位置した。このように、連鎖地図及び連鎖マーカーが、機能遺伝子のマッピング等において、容易に応用できることを示した。当年度までに、100の遺伝子座をマッピングすることが出来た。3)組換えきのこの追跡法の開発では、シイタケ組換え体DNAの定量測定法を、LTR配列およびハイグマイシン耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーならびに定量PCR装置を用いて開発した。本法は、遺伝子数で100から10の9乗コピーと広い範囲で定量性を持ち実用性が高いことも分かった。次に、本法でシイタケ組換え体中のハイグロマイシン耐性遺伝子数を定量した結果、菌株間で1000倍程度も異なることが分かり、DNA量から菌糸体量を算定する上で、染色体当たりの組換えDNAのコピー数が、重要な考慮点となることが分かった。また、表現型の特性調査の結果、一次菌糸体で隠蔽される特性、二次菌糸体で隠蔽される特性、一次および二次菌糸体の両者で隠蔽される特性があること等、組換え体の定量および追跡法を開発する上で、併せて考慮すべき点を明らかにした。4)その他の成果 新たな行政要望に対しては、次の成果を得た。「乾シイタケの産地判別法の開発」では、DNA判別法による品種分布、及び、その混在率を調査することが有効であることを明らかにした。中国産で、50％以上を占める系統A(FMC155)は、国産品では、0.7％以下と極めて少ないため、系統Ａの混在率が産地判別の指標となることが分かった。「人工栽培融合松茸の種鑑定」では、100％シイタケと鑑定できた。また、当該菌株は、30年以上前に開発された市販品種から派生し、15年前に社会問題となったマツタケ様シイタケと同一品種または系統と鑑定できた。
• カテゴリ: 育種 しいたけ データベース 品種