遺伝子増幅法による牛ヨーネ病迅速診断技術の確立

• 研究機関名: 北海道立畜産試験場
• 研究分担: 畜産工学部遺伝子工学科; 感染予防科
• 研究期間: H13～15
• 年度: 2003
• 摘要: 目的：LAMP（Loop-mediated Isothermal Amplification）法によるヨーネ菌の検出および糞便試料の処理方法を検討し、従来の培養法よりも迅速に診断する方法を確立する。方法：１）LAMP法によるヨーネ菌遺伝子検出法の開発ヨーネ菌に対する特異的なLAMP用プライマーを作製して、検出効率の高い反応条件の検討を行った。２）牛糞便からのヨーネ菌遺伝子検出法の検討牛糞便からの核酸調製法およびDNA増幅反応阻害物質の抑制法について検討し、牛糞便からのLAMP法を用いたヨーネ菌遺伝子検出法の開発を行った。成績の概要：１）ヨーネ菌の類似菌M.cookiiが同定されたため、プライマーの特異性を再度検討した結果、Primer2と反応したため、プライマーを再検討した。作製したプライマーセットPrimer3はM.cookiiを含む供試した全ての類似菌で反応がみられず、反応時間90分以内にヨーネ菌DNA0.01pgまで検出した。以下の試験にはPrimer3を用いた。２）ノンフェノールビーズ法を用いて牛糞便中のヨーネ菌DNAを調製し、反応阻害物質の作用を抑制するAmpdirect反応液を用いて検出を試みた結果、Ampdirect無しの反応液は糞便培養法陽性7試料のうち5試料検出したのに対して、Ampdirect反応液は7試料全て検出した。また、培養したヨーネ菌を添加した牛糞便希釈液からヨーネ菌DNAがおよそ5cfu/mlまで検出できた。
• 研究対象: 共通
• 戦略: 畜産
• 専門: 牛
• 部門: 家畜衛生
• カテゴリ: 飼育技術 診断技術