DD、AFLP及び銀染色を組合わせたmRNAフィンガープリンティング（DD-AFLP）法

• 担当機関: 地域基盤研究部
• 研究期間: 1999～1999
• 研究担当者: Sergey; IVASHUTA; 磯部祥子; 我有 満; 今井亮三; 内山和宏
• 発行年度: 1999
• 要約: 3'末端にpolyA配列をもつcDNA断片のみをPCRで選択的に、再現性よく増幅し、ラジオアイソトープや蛍光色素を使用せずに銀染色で検出できるDD-AFLP法は、経済的で効率の良いmRNAフィンガープリンティング法である。
• 背景・ねらい: 遺伝子をクローニングする際のmRNAフィンガープリンティングの手法として、ディファレンシャルディスプレイ(DD)法とcDNA-AFLP法がある。DD法は、3'末端側のcDNA断片を選択的に増幅する手法として開発されたが、再現性が低いという短所がある。一方、cDNA-AFLP法は、再現性が高い長所があるが、目的以外のcDNA断片も増幅するので泳動ゲル中に多くの断片が含まれる。これらの手法においては、通常、ラジオアイソトープまたは蛍光色素による標識が必要となるため、実際の利用場面では、施設や機器による制限を受ける。再現性が高く、シンプルな泳動像に対し、銀染色の適用が可能になれば、遺伝子クローニング実験の実施可能範囲が拡大する。

成果の内容・特徴

1. DD法とcDNA-AFLP法を組合せると、再現性が高く、かつシンプルな泳動像が得られ、バンドの検出に銀染色の適用が可能となる。DD-AFLP法は、マニュアル化された手法の組合せであり、既存のキットが利用できる簡便なmRNAフィンガープリンティング法である。
   
2. 再現性が高い。AFLP法との組合せにより、DD法の再現性の低さが改善される（図1）。
   
3. cDNA断片の重複がなく、カタログ化が容易である。3'末端にpolyA配列をもつcDNA断片のみを増幅するため、同一mRNAに由来するcDNA断片は、ゲル上に一度しか現れない。また、ゲノムDNAの混入の可能性が低く抑えられる。
   
4. シンプルな泳動像が得られ、銀染色で検出可能である（図2）。増幅産物のサイズは50～700bp、レーンあたりの総バンド数は30～100本である。
   
5. cDNA断片の再増幅が容易である。銀染色したゲルからのcDNA断片の切出しが容易であり、再増幅が効率的に行える。100バンド以上単離し再増幅を行った結果、約65％がシングルバンドである。Oligo-dTプライマーとMse-Iプライマーの配列を含む目的のcDNA断片が増幅されていることがシークエンスにより確認された。低温ストレス前後および品種間で発現量が変化するcDNA断片をゲルから単離した結果、発現量の変化をノーザン法で確認できるものが含まれている。
   

• 成果の活用面・留意点: ストレス等により特異的に発現する遺伝子を効率よく安価にクローニングする方法として活用できる
• カテゴリ: 品種