イムノキャプチャ-RT-PCR及びハイブリダイゼーション法によるキクえそ病の診断

• 担当機関: 愛知県農業総合試験場
• 研究期間: 1997～1999
• 発行年度: 1997
• 要約: イムノキャプチャ-RT-PCR法により、キクの無発病株から高率にトマト黄化えそウイルス（TSWV）を検出できる。また、本法とハイブリダイゼーション法を組み合わせるとさらに高感度になりTSWVフリー苗の選抜にも利用できる。
• 背景・ねらい: トマト黄化えそウイルス（TSWV）によるキクえそ病が全国的に発生し問題化している。キクの無発病株からは、ELISA法などの免疫学的検出法やハイブリダイゼーション法ではウイルスの検出が困難であり、RT-PCR法とハイブリダイゼーション法を組み合わせないと検出することができない。; 一方、キクの抽出液はRT-PCRを阻害する物質を含むため、簡易抽出した試料ではRT-PCRができない。このため、最適プライマーを利用したイムノキャプチャ-RT-PCR法によるキクの無発病株のTSWV検定法及び本法とハイブリダイゼーション法の組み合わせによるウイルスフリー苗選抜法を確立する。

成果の内容・特徴

1. TSWVのヌクレオキャプシドに対する抗体を用いたイムノキャプチャ-RT-PCR法により（図1）、ウイルス遺伝子を高率に増幅することができる（図2）。
   
2. TSWVのS及びM遺伝子用のプライマーを設計し、TSWVによるキクえそ病発病葉及び無発病葉を用いてイムノキャプチャ-RT-PCR法を行ったところ、M遺伝子のNsmタンパクをコードする領域内を増幅できるプライマーが最も増幅効率がよく、健全葉からはウイルス遺伝子が検出されなかった（図2）。
   
3. 増幅された遺伝子をクローニングして塩基配列を解析したところ、目的とする領域を増幅していることが確認された。
   
4. RT-PCR後の産物をNsm領域のプローブでハイブリダイゼーションを行ったところ、より高感度なTSWV検定ができたため（図3）、両法の組み合わせ法はキクのTSWVフリー苗の選抜に利用できる。
   

成果の活用面・留意点

1. 抗体処理したチューブは-20Cで長期間保存することができる。
   
2. RT-PCR法のみでは無発病株からウイルス遺伝子を検出できない場合があるので、その場合はハイブリダイゼーション法を併用する必要がある。
   

• カテゴリ: きく