早期性判定によるウシ体外受精由来胚盤胞の超低温保存技術

• 担当機関: 兵庫農総セ
• 研究期間: 2000～2005
• 研究担当者: 冨永敬一郎; 大塚由佳子
• 発行年度: 2002
• 要約: 性判定のために体外受精後3、4日目に1～2割球をサンプリングした後、胚盤胞へ発生したウシ胚をゲル・ローディング・チップガラス化法により超低温保存すると、サンプリング後の胚盤胞への発生率及び胚盤胞のガラス化後の生存率を低下させることなく、移植により子牛を生産できる。
• キーワード: ウシ体外受精胚、胚盤胞、性判定、ゲル・ローディング・チップ、ガラス化
• 背景・ねらい: 性判定のために切断刃でサンプリングしたウシ体外受精由来胚盤胞の凍結は難しく、ゲル・ローディング・チップ (GL-Tip) ガラス化法（Tominaga and Hamada, 2001）を用いた場合でも、加温後の生存率は10～20%低下する。また、乳牛では雌胚のみ必要であるが、雌が多い低品質胚のサンプリング後の凍結はさらに難しい。; そこで、受精後3、4日目で細胞間結合の弱い8～16細胞期胚から1～2割球を押し出し法でサンプリングし、そのサンプルを用いたPrimer Extension Preamplification (PEP) - PCR法 (Chreneket al., 2001) による性判定技術と、発生した胚盤胞のGL-Tipガラス化法とを組み合わせた性判定胚の超低温保存技術を検討する。
• 成果の内容・特徴: 1.; 押し出し法で採取したサンプル割球の核をヘキスト染色して蛍光顕微鏡で確認する（図1）ことにより、15～20%起こるサンプルの採取ミスを防ぐことができる。; 2.; 体外受精3及び4日目にサンプリングした8～16細胞期胚の7日目胚盤胞への発生率は対照区 (サンプリングしない) と差はない（表１）。; 3.; 免疫蛍光２重染色により内部細胞塊細胞と栄養膜細胞を別々に計測した結果、胚盤胞の細胞構成でも対照区とに差はみられない（表１）。; 4.; 体外受精3及び4日目の8～16細胞期胚をサンプリングし、発生した胚盤胞のガラス化後の生存率は対照区と差はみられない（表２）。; 5.; 経膣採卵で採取した卵子を成熟培養後体外受精し、4日目にサンプリング後性判定した。7日目に胚盤胞になった１個の雌と判定した胚をGL-Tip法でガラス化し、加温後移植して判定どおりの雌子牛を生産した(図２)。; 6.; 性判定のため８～16細胞期にサンプリングしたウシ体外受精由来胚盤胞のGL-Tipガラス化により、胚盤胞への発生率及びガラス化保存後の生存率は低下せず、正常な子牛を生産できる。
• 成果の活用面・留意点: 1.; 廃用牛卵巣、経腟採卵や核移植に関連した胚の性判定に応用できる。; 2.; サンプリング、PEP-PCRや性判定技術は高度な技術の複合技術であるため、個々の技術を完全に習得する必要がある。; 3.; 移植のための性判定では市販のプライマーを利用しなければならない。; 4.; これまでの成果情報を参考にする。
• カテゴリ: 乳牛