キュウリ黄化ウイルスの低コストの遺伝子診断法

• 担当機関: 生産環境室
• 研究期間: 2003～2004
• 研究担当者: 栗坂信之; 奈尾雅浩
• 発行年度: 2004
• 要約: 一本鎖RNAのキュウリ黄化ウイルス（CuYV）はRT-PCRにより遺伝子診断が可能である。ウイルスの核酸抽出液を自家調整し、核酸抽出のためのサンプル重量とRT-PCRの反応液量を微量化することにより、1サンプルあたり約100円でウイルスが検出できる。
• キーワード: キュウリ黄化ウイルス、CuYV、RT-PCR、低コスト、遺伝子診断
• 背景・ねらい: 2002年、愛媛県南予地域の露地キュウリを中心にキュウリ黄化病が5haで発生した。本病は一本鎖のRNAのキュウリ黄化ウイルス（CuYV）が原因であるが、抗血清が作製されていないため、診断にはRT-PCR法による遺伝子診断を利用する必要がある。しかし、本法は高価で多検体の診断には不向きであるため、低コスト化を検討する。

成果の内容・特徴

1. ウイルスの核酸はキュウリ葉からAGPC法(Acid Guanidium-Phenol-Chloroform法)で抽出できる（図1）。AGPC法に用いる試薬は自家調整する。
2. RT-PCRは1ステップRT-PCRキット（Promega社製AccessQuick™）とCuYVのコートタンパク質遺伝子を検出するプライマー（近畿中国四国農業研究センター設計）を用いて、反応液量5μL（PCR装置:TaKaRa社製
   TP-3000、PCRチューブ：Applied Biosystems社製 MicroAmp®）でウイルスの検出が可能である。（図2，3）
3. ウイルスは1.5mLマイクロチューブのフタで打ち抜いたキュウリ葉のディスク(約0.05g)から抽出したサンプルから検出できる。（図4）
4. キュウリ葉サンプルは穴を潰した1mLマイクロピペット用チップを用い1.5mLマイクロチューブ内で粉砕する。
5. RT-PCRで検出したCuYVのコートタンパク質遺伝子バンドの塩基配列約400bpは、同様のウイルスの既報の配列（AB085612、AY330919）と塩基ベースで各々92.4％と89.6％の相同性がある。
6. CuYVの遺伝子診断は約7時間で行え、1サンプルあたり約100円で診断が可能である。（表1）

成果の活用面・留意点

1. マイクロチューブのフタで打ち抜いたキュウリ葉のサンプルは、-20℃で６か月間保存可能である。
2. サンプルはキュウリ展開葉の基部から採取する。
3. RT-PCRの反応液量を5μLで行うときは反応中の蒸発を防ぐため、チューブの密閉に留意する。
4. 遺伝子診断の経費は消耗品の購入価格より計算している。

• カテゴリ: きゅうり 低コスト