バキュロウイルス遺伝子発現系におけるウシインターフェロンーτの糖鎖構造の改変

• 担当機関: 家畜衛生試験場
• 研究期間: 1995～2000
• 発行年度: 1999
• 要約: ウシインターフェロンーτ（boIFN-τ）を昆虫細胞で発現させる際，ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ遺伝子導入昆虫細胞株を用いることにより発現タンパク質の糖鎖構造を昆虫型から哺乳類型へと改変した。
• 要約(英語): Recombinant bovine interferon-tau (rboIFN-t) bearing manmarian-type N-glycan are expressed by the baculovirus expression system. rboIFN-t were expressed with Sfβ4Gal/α2,6ST cells (stably transformed cell line that expressed beta-1,4-galactosyltransferase and alpha 2,6-sialyltransferase). rboIFN-t strongly reacted with ConA, RCA-120 and SNA in lectin bloting. It indicates that N-glycan of rboIFN-t contains mannose, galactose and sialic acid. In this result, mammalianized foreign glycoprotein with N-glycan containing galactose and sialic acid was produced in the baculovirus expression system. (Lab. of Bioengeneering Research, Biological Products Research Division TEL [phone])
• 背景・ねらい: バキュロウイルスー昆虫細胞発現系はタンパク質の生産に広く利用されている。し かし昆虫細胞内で付加されるN結合型糖鎖は，昆虫細胞がガラクトシルトランスフェ ; ラーゼ（ＧＴ）およびシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）活性を欠くため，図１の 経路１に示すようにトリマンノシルコアとなるとされている。糖鎖は動物体内での活 性や安定性において重要な役割を果たしていると考えられるので，哺乳類に投与する ためには哺乳類型糖鎖を持つ必要が生じる可能性がある。そこで哺乳動物細胞由来の 組換え型タンパク質を経路２によってコンプレックス型糖鎖が付加された形で発現さ せるため，Ｎ結合型糖鎖結合部位を１カ所有するboIFN-τをモデルとし，ＧＴ遺伝子 およびＳＴ遺伝子導入昆虫細胞株を用いた発現生産を試みた。

成果の内容・特徴

1. boIFN-τ遺伝子組換えバキュロウイルス(AcBIFNτ)を作成し，Sf21AE（Sf）細胞を用いて約22kDaの組換えboIFN-τ(rboIFN-τ)を発現させた(図２)。
   
2. Sfβ4Gal/α2.6ST細胞（beta-1,4-GT遺伝子およびalpha-2.6-ST遺伝子導入Sf細胞株:Dr. Jarvisより分与された）にAcBIFNtを感染させたところ，糖鎖構造の差違によると思われる約23.3kDaのバンドが検出された（図２）。これが，rboIFN-τであることをウエスタンブロット法により確認した。
   
3. ペルオキシダーゼ標識したConA，RCA-120，SNAを用いたレクチンブロットを行い，それぞれマンノース，ガラクトース，シアル酸の検出を行った（図３）。Sf細胞由来のrboIFN-τはConAと強く反応し，さらにRCA-120およびSNAとも非常に弱くではあるが反応したことから，Sf細胞が低いながらもGT活性，ST活性を有することは示された。また，Sfβ4Gal/α2.6ST細胞ではRCA-120，SNAとの反応性が増強されており，発現したrboIFN-τの糖鎖がトリマンノシルコアからコンプレックス型へと改変されたことが示唆された。
   
4. 培養上清を用いてプラーク減少法によりrboIFN-τの抗ウイルス活性を測定したところ，どちらの細胞で発現させたrboIFN-τも同程度の活性を示し，糖鎖構造はboIFN-τの抗ウイルス活性にはほとんど影響しないことが明らかとなった（図４）。
   

成果の活用面・留意点

　 昆虫細胞でコンプレックス型糖鎖をもったタンパク質を発現させることが可能となった。臨床応用の際にバキュロウイルス発現系タンパク質に哺乳類型糖鎖を付加する必要がある場合，本法を用いて付加することができる。さらに，付加された哺乳類型糖鎖の構造や付加効率について検討する必要がある。