Streptococcus suis遺伝子ノックアウト用温度感受性ベクターの構築

• 担当機関: （独）農業技術研究機構 動物衛生研究所
• 研究期間: 2001～2005
• 研究担当者: 関崎 勉; 高松大輔; 大崎慎人
• 発行年度: 2001
• 要約: 豚レンサ球菌Streptococcus suisの遺伝子を効率よく破壊するための温度感受性ベクターを開発した。また，作製したベクターを用いてS. suisのsly遺伝子を破壊することによって，その有用性を実証した。
• 要約(英語): 5. Construction of thermosensitive suicide vectors for gene replacement in Streptococcus suis; Three thermosensitive (Ts) suicide vectors, pSET4s, pSET5s, and pSET6s have been constructed for gene replacement in Streptococcus suis. Each vector contains an antibiotic-resistance gene (spc or cat), a Ts replication origin of pG+host3, as well as multiple cloning sites, lacZ' and the ColE1 replication origin of pUC19. These vectors could be propagated at 37℃ in Escherichia coli, but their replication was blocked above 37℃ in S. suis. Moreover the thermosensitivity of the replication origin was confirmed in S. equi ssp. equi, S. equi ssp. zooepidemicus, and S. dysgalactiae by using pSET4s. For inactivation of the sly gene, which encodes a cholesterol-binding cytolysin of S. suis, pSLYK, in which the sly gene was interrupted by the cat gene, was constructed using pSET4s and introduced into S. suis DAT2. After growth at the nonpermissive temperature under antibiotic pressure, the chromosomal sly gene was replaced with the sly::cat gene of pSLYK by a double-crossover event at a rate of 2.6% among chloramphenicol-resistant cells. These results indicate that the Ts suicide vectors described here will facilitate the genetic analysis of S. suis and other streptococci of veterinary importance by means of allelic exchange of the genes of interest via homologous recombination. (Molecular Bacteriology Section, Department of Infectious Diseases, TEL [phone]); Reference:; Takamatsu et al.（2001）Plasmid 46:140-148.
• キーワード: 豚レンサ球菌，Streptococcus suis，温度感受性ベクター，遺伝子破壊，sly遺伝子
• 背景・ねらい: これまでS. suisで遺伝子破壊株を作製する際は，pUC19の様なグラム陽性菌内では複製が出来ないベクターを用いていた。しかし，この方法で遺伝子破壊株を得るためには，効率の良い遺伝子の導入系が必要であるため，S. suisでは応用できる株が限られる。そこで，形質転換の効率に拘わらず高率に目的の遺伝子を破壊するための温度感受性ベクターを作製し，その応用を試みた。
• 成果の内容・特徴: 1.; pG+host3の温度感受性(Ts)replication origin(ori)に抗生物質耐性遺伝子（catまたはspc），MCSを含むlacZ’遺伝子，およびE. coli内では培養温度に拘わらず複製が出来るようにColE1プラスミドのoriを付加した３種のベクターpSET4s, pSET5sおよびpSET6sを作製した（図1）。; 2.; 今回使用したTs oriはS. suis内だけでなくStreptococcus equi subsp. equi, S.; equi subsp. zooepidemicus，およびStreptococcus dysgalactiae内においても37℃ではプラスミドの複製が阻害されることが確認された（表1）。; 3.; pSET4sを用いて，S. suisのコレステロール結合型細胞障害毒素をコードするsly遺伝子の大部分をクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）に置き換えた株（SLY1株）を作製することに成功した（図2）。また，培養上精の溶血活性を調べることにより，この株がS. suis sly遺伝子破壊株であることを証明した（表2）。
• 成果の活用面・留意点: 1.; 本研究によって確立されたS. suisの効率の良い遺伝子破壊系は，本菌の病原因子の解明にとって有益な遺伝子解析ツールになると考えられる。また，S. suisだけでなく，未だ有用な遺伝子破壊系が開発されていない家畜衛生にとって重要なその他のレンサ球菌への応用も期待される。
• カテゴリ: GPS 飼育技術 豚