反復DNAの効率的増幅を目的としたレーザー微細操作による染色体標本の作製法

• 担当機関: 北海道農業試験場
• 研究期間: 1993～1993
• 発行年度: 1994
• 要約: レーザー微細操作により得られたギムザ染色染色体からのDNAの増幅に固定液中での標本の保存は問題なく、また、染色による保存性の低下も脱色により回復する。本方法により1本の染色体を残した標本から反復DNAの増幅が再現よく行われた。
• 背景・ねらい: 有用遺伝子を効率的に解析するため、マイクロクローニング手法による簡便な染色体特異的ライブラリーの作製法の開発が必要とされている。そこで、レーザー微細操作法を用いて標本作製法が染色体からのDNA増幅に与える影響を検討し、少数染色体からのDNAを増幅するための標本作製法の開発を試みた。

成果の内容・特徴

1. 　ウシ血液を培養後、染色体試料を薄膜上で標本作製した。ギムザ染色後、薄膜上においてレーザー微細操作により得られた少数染色体からDNAを増幅するための、標本の固定法・保存法の検討を行った（表1）。
   
2. 　メタノールと酢酸の混合比については影響がなく、1ヶ月の保存でもDNA増幅に影響がみられない。
   
3. 　ギムザ染色を行った標本については、数日の保存でDNAの増幅が悪くなったが、メタノールで脱染色をした後で保存すると保存性が回復する。
   
4. 　本法で作製した標本に対するレーザー微細操作は容易で、一核板から特定の染色体を選択して、他の染色体を除去するための時間は10から20分程度である（図1）。
   
5. 　本法で作製した標本からPCR法を用いて、薄膜上のY染色体1本からY染色体特異的反復DNAの増幅を行うことができる（表2）。
   

成果の活用面・留意点

1. 　反復DNA配列の増幅については、ネガティブコントロールからの増幅もみられるが比較的再現性良く行え、多くの染色体に存在する類似のDNA配列の染色体間比較に用いることが可能である。
   
2. 　シングルコピーもしくは小コピー数のDNAの増幅については、プライマーの選択を始めとする増幅過程に関する検討が必要である。