乳酸菌のプロテイナーゼ遺伝子のクローニングと塩基配列

• 担当機関: 畜産試験場
• 研究期間: 1995～1997
• 発行年度: 1995
• 要約: 乳酸球菌(Ｌactococcus lactis）のプロテイナーゼ遺伝子をプロテイナーゼ非生産株にクローン化し、発現させた。さらに、プロテイナーゼ遺伝子とその近傍の塩基配列（ 7731bp ）を決定した。
• 背景・ねらい: チーズなどのスターターとして用いられるＬactococcus lactisのプロテイナーゼは、遊離アミノ酸の少ない牛乳中での乳酸球菌の生育には不可欠であり、また発酵乳製品の風味などにも大きく貢献している。しかし、プロテイナーゼ生産性は遺伝的に不安定で、プラスミドにコードされると考えられる。本研究は、このプラスミドの機能を確認し、プロテイナーゼ遺伝子の構造を明らかにすることにより乳業用乳酸菌の育種改良に資することを目的とする。

成果の内容・特徴

1. 　Ｌ．lactisからプラスミドを単離し、制限酵素により部分分解したフラグメントをベクターに連結し、Ｌ．lactis　のプラスミドフリー株（プロテイナーゼ非生産株）に形質転換し、プロテイナーゼ活性を示す株を選択した（図1）。
   
2. Ｌ．lactis５株からプロテイナーゼ遺伝子がクローン化され、これらはα、β－カゼインを分解する基質特異性などからＰⅢタイプセリンプロテイナーゼであることが示され、これらの制限酵素地図は相同性を示した（図2）。
   
3. Ｌ．lactis 565株からクローン化されたＨindⅢ6.5kbフラグメントについて塩基配列を決定したが、プロテイナーゼ遺伝子（ prtＰ ）のＣ末端が欠けていたため、さらにサザンハイブリダイゼーションによりＣ末端をカバーする ＰstＩ-ＥcoＲＶ1.5kb フラグメントをクローン化し、全長 7731bpなかに1960アミノ酸残基コードする prtＰの全塩基配列を決定した。
   
4. 塩基配列から推定されるアミノ酸配列を既報のＬ．lactisプロテイナーゼと比較すると、Ｍetから始まる33アミノ酸配列は同一で、Ａ1a-Ｘ-Ａ1a-Ａ1aモチーフがシグナルペプチターゼⅠで開裂するＳec 依存性シグナルシークエンスであり、つづく152アミノ酸残基はプロシークエンスで、この部分には２アミノ酸の欠失がみられる。セリンプロテイナーゼの活性中心となる、Ａsp30,Ｈis94,Ｓer433には変化はなく、基質結合に関与すると考えられている部分はＴhr138, Ａsp166,Ｌeu747,Ｔhr748でＬ．lactis Ｗg2ＰⅠタイププロテイナーゼと一致した。Ｃ末端側にはＬ．lactis ＳＫ11と同じく180bpの繰り返し配列があり、ＰⅠタイププロテイナーゼ（Ｌ．lactis Ｗg 2,763）より60アミノ酸残基分長い。結果的に、prtＰ全体として、既報のＷg2,763,ＳＫ11とは29,31,66アミノ酸の違いが認められた。
   
5. prtＰの上流には、ＡＴリッチでプロモーターを含む領域をはさんで逆向きにプロテイナーゼの熟成に関与するマチュラーゼ遺伝子（prtＭ）が存在するが、既報の配列と同一で、保存性が高かった。
   

成果の活用面・留意点

Ｌ．lactisプロテイナーゼ遺伝子をクローン化し、塩基配列を決定したことにより、プロテイナーゼの安定化などの育種改良への基礎を開き、菌株間での活性や特異性の違いを比較する素材を提供した。

• カテゴリ: 育種