N-アセチルキトオリゴ糖エリシターにより発現誘導されるEL5遺伝子のRING-H2 finger domainの溶液構造とその機能に関する研究

• 担当機関: （独）農業生物資源研究所
• 研究期間: 2000～2002
• 研究担当者: 加藤悦子; 山崎俊正; 南栄一
• 発行年度: 2001
• 要約: 植物には感染に対する防御機構が存在する。このような防御反応の一部は、培養細胞にエリシターを処理することにより再現できる。EL5はエリシター処理により初期誘導されるイネの遺伝子であり、その遺伝子がコードする蛋白質の機能は不明であった。本研究では、EL5のRING-H2 finger domainに着目し、その立体構造を溶液NMRにより解明し、分子機能の推定を行った。
• キーワード: RING-H2 finger、NMR、立体構造、エリシター、ユビキチンプロテアソーム系
• 背景・ねらい: タンパク質の機能は、分子の立体構造に基づく機能性アミノ酸残基の効果的立体配置の結果、他の生体分子と相互作用することにより生体超分子を形成して発現される。そのため、機能未知タンパク質の構造と機能の相関を解明することは、新機能物質の分子設計や生体機能制御等のバイオテクノロジー分野に大きく道を開くと期待される。本研究では、機能未知の蛋白質EL5に着目し、その蛋白質の立体構造を解明し、その分子機能を推定した。
• 成果の内容・特徴:
• EL5のRING-H2 finger domainの大量発現系の構築および精製法を確立し、NMR測定に必要な高純度・高濃度の安定同位体標識サンプルを精製することに成功した。;
• 得られた安定同位体標識サンプルについてNMR測定およびコンピュータシュミレーションによりEL5のRING-H2 finger domainの立体構造を解明した（図1）。その結果、このドメインはいくつかの機能の異なるRING finger domainのホールディングと類似していることが明らかとなった。このことから、蛋白質のホールディングだけからでは、その分子機能は推定できないことが明らかとなった。;
• EL5のRING-H2 finger domainの立体構造について、構造と機能が既知なRING finger domainとの比較を分子レベルで行った。現時点で、構造と機能の両者が既知なRING finger domainは、2種類（RAG1およびc-Cbl）報告されている。RAG1のRING finger domainはタンパク質の2量化に関与しており、EL5は単体で存在していることからRAG1と同様の2量化の分子機能はないことが分かった。一方、c-Cblはユビキチンプロテアソーム系においてユビキチンリガーゼ（E3）として機能しており、RING finger domainはユビキチン結合酵素（E2）との結合に関与しており、shallow grooveと呼ばれる疎水性のアミノ酸残基により形成される溝によりE2と結合していることが近年明らかとなった。EL5とc-CblのRING finger domainの構造を原子レベルで詳細に検討した結果、EL5にはc-Cblと同様な空間的な溝が存在し、さらにその溝は疎水性のアミノ酸残基により構成されていることが分かった（図2（a）および（b））。このことから、EL5のRING-H2 finger domainはE2の認識領域であり、EL5はE3として機能すると推定した。;
• 共同研究者によるマイクロアレイ実験の結果から、エリシター処理によりマウスのE2と非常に相同性の高い遺伝子が初期誘導されることが明らかとなった。この結果は、EL5の分子機能が立体構造から予測した我々結果と一致している。;

成果の活用面・留意点

NMR滴定実験や物理化学的な手法を用いて、EL5のRING-H2 finger domainのE2認識機構を解明する。また、E2の大量発現系を構築し、E2の立体構造を解明する。その結果をもとにE2のEL5（RING-H2 finger domain）の認識機構を解明する。

• カテゴリ: 機能性