細胞ミクロ電気泳動法の改良とそれによる卵胞内細胞のＤＮＡ損傷の検出

• 担当機関: 山形県農業研究研修センター
• 研究期間: 1998～1998
• 発行年度: 1998
• 要約: 細胞ミクロ電気泳動法の一つであるティアドロップアッセイの改良法で、細胞レベルで卵胞内細胞のDNA損傷が検出できる。
• 背景・ねらい: DNA損傷の生化学的検出は、抽出したDNAを電気泳動し、; ラダーを検出することで行われるが、この方法は細胞数が多い場合に有効である。; 細胞数が少ない場合、細胞ミクロ電気泳動によって個々の細胞レベルでDNA損傷を; 検出できるが、検査に時間を要することや、アガロースゲル作成に熟練を要するなどの; 問題がある.そこで、; 細胞ミクロ電気泳動法の一つであるティアドロップアッセイを改良し、; 卵胞内細胞のDNA損傷検出を試みた。

成果の内容・特徴

1. 方法
   低融点アガロース(Sigma type VII)をPBS(-)で4%に溶解し、60度Cに保温した。
   38度Cに保温したスライドグラスに、4%アガロースを10～25μlとり、
   細胞懸濁液を2μlを加えて、ピペットチップで素早くかき混ぜ、
   ついで18mm×24mmのカバーグラスを乗せて軽く押さえ、全面にアガロースを拡げた。
   この際、カバーグラスは対角の角がスライドグラスからはみ出すように乗せた。
   ついで、スライドグラスに十分な量の蒸留水を噴霧し、冷蔵庫中に10分間静置し、
   アガロースを固化させ、カバーグラスの一端をピンセットで摘んでカバーグラスを
   剥がした。そうすることにより、アガロースゲルはカバーグラスに付着するので、
   ゲル付着面を上にしてカバーグラス上で10分間細胞融解し(1%サルコシン酸ナトリウム、
   2.5M NaCl、100mM Na₂-EDTA、10mM Tris、pH10、1% TritonX- 100、
   用時調製)、40mM TAE緩衝液(pH8.0,液の深さ約5mm)を用い、
   電圧2V/cmで10分間電気泳動を行い、
   DAPI(2μg/ml DAPI、10mMTris:pH 7.4、10mM EDTA、100mM NaCl)
   で染色したのち蛍光顕微鏡で観察した。
   
2. 試料の調製
   卵胞内の細胞は牛の卵巣から採取したが、正常な小卵胞と出血した小卵胞では
   10～20個を吸引し卵丘卵子複合体を除いて残った細胞を1検体とし、
   大卵胞及び出血した大卵胞は5個程度を吸引して1検体とした。
   それぞれを遠心して上清を捨て、管壁に残った溶液に沈殿を懸濁して、
   約50%の細胞懸濁液とした。
   
3. 結果
   出血を伴った小卵胞由来の細胞(写真1)
   及びクモの巣状の卵丘卵子複合体由来の細胞
   (写真2)でスメア状のDNAの泳動像が観察されたが、
   正常卵胞、大型卵胞、及び出血を伴った大型卵胞由来の細胞では、
   いずれもスメア状泳動像は観察されなかった。
   表1 個々の細胞でのDNA損傷の検出成績

成果の活用面・留意点

1. アポトーシスの研究に応用できる。
   
2. 細胞塊等が大きい場合はアガロース量を増やし、細胞融解時間を延長する。