ウシ胚の性判別における生存性の高いバイオプシー手法

• 担当機関: 山形県農業研究研修センター
• 研究期間: 1999～1999
• 発行年度: 1999
• 要約: ウシ胚に金属刃を押し当てた後、顕微鏡のステージを刃の先端方向にスライドさせて胚の一部をねじり切ることにより、バイオプシー後の胚の生存率、さらにバイオプシー胚のガラス化後の生存性の高い手法を開発した。
• 背景・ねらい: ウシ胚の性判断は実用段階にあるが、胚の一部をバイオプシーすることで耐凍性; が低下し、受胎率も低下する。そこで、従来から行われている金属刃による; バイオプシーを改良し、生存性が高く、耐凍性のあるウシ性判別胚を生産する。

成果の内容・特徴

1. 改良したバイオプシー法
   従来の方法は、金属刃(FEATHER社:MICRO-FEATHER BLADES15)を押し当てて刃を
   動かすことにより切り取る手法であるが、改良法は刃を押し当てた後、金属刃の
   先端方向に顕微鏡のテーブルをスライドすることにより、胚を回転しながら
   ネジリ切る手法(改良法)である。
   
2. バイオプシー後の胚の生存性
   体外受精胚を用い、組織培養用Dish(FALCON3002)上の0.2Mトレハロース加PBSの
   中で従来法及び改良法でバイオプシーした。バイオプシー胚は24時間培養
   (IVD-101 培地:低酸素培養)し胞胚腔の形成で生存率をみた。その結果、従来法で
   68.8%(22/32)、改良法で82.9%(29/35)であった
   (表1)。
   
3. バイオプシー胚のガラス化後の生存性
   従来法及び改良法でバイオプシーした体外受精胚を、バイオプシー直後
   (0時間培養区)及び24時間培養後(24時間培養区)にガラス化保存し、加温後
   48時間まで培養し生存率を調べた。ガラス化及び加温は、以下の方法を用いた。
   前平衡として、3%エチレングリコール+0.2Mトレハロース+20%CS加 PBS に入れ12～
   15分間室温放置した。室温のガラス化液(20%エチレングリコール20%+
   20%DMSO+0.3Mトレハロース+20%PVP+20%CS加PBS+フェノールレッド)に入れ、
   直ちにストローに吸引し氷上で2分間保持後、液体窒素中に入れた。加温は、
   20度Cの水中に15秒間入れ、室温の0.5Mシュークロース+20%CS 加 PBS中に
   ストロー内容物を出し、培地で荒い5分間放置。次に20%CS 加 PBS中に10分間
   放置し行った。
   加温後48時間までの生存率は、0時間培養区及び24時間培養区で33.3%(8/24)及び
   63.6%(14/22)、改良法ではそれぞれ66.7%(12/18)及び54.5%(12/22)であった
   (表2)。
   

• 成果の活用面・留意点: 性判別胚移植に関する基礎知見である。