細胞ミクロ電気泳動法を用いた胚細胞のDNA断片化の検出

• 担当機関: 山形県農業研究研修センター
• 研究期間: 1999～2002
• 発行年度: 1999
• 要約: あらかじめ胚の透明帯をタンパク分解酵素処理し、細胞ミクロ電気泳動を行うことによって、胚の細胞レベルでのDNA断片化が検出できる。
• 背景・ねらい: 胚初期発生において、酸化ストレスによる発生障害が起こることが推測されている; が、障害の発生機序は明らかではない。そこで、初期発生における酸素障害の; 発生機序を解明する目的で、胚の細胞単位でのDNA断片化検出手法を検討した。

成果の内容・特徴

1. 方法
   あらかじめ0.5%プロナーゼで透明帯を軟化させた牛胚を4%低融点アガロースに
   包埋し、カバーガラスを載せ、蒸留水を噴霧して冷蔵庫中に置いて寒天を固化
   させたのち、カバーガラスをはがして寒天層をカバーガラス面に付着させ、10
   分間細胞融解したのち電気泳動し、DAPIで染色し蛍光顕微鏡でスメア状の泳動像
   を観察する。
   
2. 結果
   卵割期の体外受精による初期胚は、割球分離が容易なため、個々の細胞でのスメア
   状泳動像が観察でき、桑実胚以降では、正常な部位が細胞塊のままスメア状の
   泳動像が観察された。
   体外受精による正常胚盤胞、発生停止胚、凍結融解後の胚などで、細胞レベルでの
   DNA断片化が検出されたが、全ての胚細胞のDNA断片化(グローバルアポトーシス)
   は見られなかった(表1)。
   

• 成果の活用面・留意点: 細胞レベルでのDNA断片化を検出することによって、胚の培養及び凍結条件の; 検討に利用できる。割球の大きさに合わせてアガロース層の厚さを調整しないと; 胚細胞が破裂するので、割球が大きい場合(細胞数が少ない場合)は; アガロース量を多くする必要がある。