カテコールを内標準としたHPLCによる緑茶機能性成分の一斉分析方法

• 担当機関: （独）農業・食品産業技術総合研究機構 野菜茶業研究所
• 研究期間: 2006～2007
• 研究担当者: 山口優一; 水上裕造; 澤井祐典
• 発行年度: 2007
• 要約: カテコールを内標準とする高速液体クロマトグラフィーにより、緑茶に含まれる８種のカテキン、３種のメチルキサンチン、ストリクチニンおよび没食子酸を60分以内に一斉分析できる。
• キーワード: 内標準法、カテコール、カテキン、茶の成分分析、HPLC
• 背景・ねらい: 緑茶に含まれるカテキン、ストリクチニン、カフェイン等の成分は様々な機能が明らかにされており、主に高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による分別定量が行われている。しかし、内標準法を用いてこれらの成分を一斉分析する報告はない。そこで、カテコールを内標準として用いて８種のカテキン、３種のメチルキサンチン、ストリクチニンおよび没食子酸を一斉分析する方法を提供する。

成果の内容・特徴

1. 内標準のカテコール70 mgとアスコルビン酸180 mgを100 mL容の全量フラスコに入れ、超純水で定容したものを内標準液とする。各標準試薬４mgから17 mg秤取り、アスコルビン酸180 mgと合わせて100 mL容の全量フラスコに入れ、超純水で定容したものを検量線作成用等の標準液とする。
2. HPLC分析で用いる移動相Aは２L容の全量フラスコにリン酸５mLを加え超純水で定容し、アセトニトリル100 mLと混合する。移動相Bは移動相Aとメタノールを５：１（v/v）の比で混合する。
3. ODSカラム(Wakopak Navi C18-5; ５µm, 4.6 × 150 mm)を２本直列接続してカラムオーブン内に設置し、温度40℃下で図１に示す条件により成分を溶出させる。移動相の流量は試料導入後30分まで1.0 mL/分、その後1.5 mL/分とする。検出波長210 nmのクロマトグラムを得て、内標準に対する相対ピーク面積を算出する。
4. 内標準に対する相対ピーク面積から各成分を定量するための検量線の傾き、検出限界および定量限界を表１に示す。約2000時間分析しても検量線の傾きは変化しない。
5. 茶系飲料や茶浸出液に含まれる成分を分析する場合、その１mLに対し内標準液２mLと超純水３mLを加え、0.45µmのフィルターでろ過し、10µLをHPLCに導入する。市販の茶系飲料を本手法で分析することにより、内標準とともに、８種のカテキン、３種のメチルキサンチン、ストリクチニンおよび没食子酸を検出できる（図２）。

成果の活用面・留意点

1. 分離カラムはエンドキャッピング処理されたODSカラムであり、粒子径５µm において長さ300 mm以上（今回、150mmのカラムを２本使用）確保すれば製造元やロットの影響を受けずに成分を分離できる。Hitachi社製のHPLCシステムを用いたが、他社製のシステムにも適用できる。ただし、その場合は検量線を作成し直す必要がある。
2. 標準液は温度－30℃下で凍結させれば約１年間保存できる。ただし、解凍したら常温（20℃～25℃）で１日以内に、冷蔵（10℃）で３日以内に使用する。
3. 分析中に各成分の減少を防ぐためアスコルビン酸を添加する。従って、緑茶中のアスコルビン酸は本手法で定量できない。
4. HPLC用のアセトニトリルおよびメタノールを用いる。

• カテゴリ: 機能性成分 茶