微生物・酵素利用による糖質資源の高度利用

• 課題番号: 2003004411
• 研究機関名: 森林総合研究所
• 研究分担: 森林総合研究所
• 研究期間: 継続2001～2005
• 年度: 2003
• 摘要: 微生物・酵素利用による糖質資源の高度利用当年度の試験研究方法：1）T. virideのCBH Iを精製し、基質結合ドメイン、触媒ドメインを分離精製する。また、ゲノムDNAから基質結合ドメインをコードする領域をPCRによって増幅し、大腸菌により融合タンパク質を発現させる。これらの結晶セルロースへの作用の観察のため、原子間力顕微鏡での観察法を勘案する。2）ランダム変異の導入とスクリーニングの繰返しにより変異酵素のアルカリ側での更なる活性向上を図る。ホモロジーモデリングにより作製した変異酵素の立体構造から、アミノ酸置換による耐熱性やアルカリ性での活性の向上の影響を解析する。3）カラマツのキシラン、グルコマンナンの水溶性画分における2,5-DMHQを介するフェントン反応による分解反応を明らかにする。培養したオオウズラタケから酵素を精製する。4）オオウズラタケからグルコシダーゼ粗酵素を調整してグルコピラノシドの酵素加水分解率を調べる。5）エノキタケ菌床の培養前後の成分変化を分析し、廃菌床に500kGy（10kGy/h）のγ線を照射してその酵素糖化率を測定する。当年度の研究成果：1）パパイン処理により酵素の触媒ドメインは分離精製されたが、結合ドメインの分離は困難であった。そこでチオレドキシンと結合ドメインとの融合タンパク質として大腸菌による発現を行い、このタンパク質の結晶セルロースへの吸着を確認した。原子間力顕微鏡により、酵素処理直後のセルロース結晶の変化を観察した。2）最終的に得られた変異酵素は親酵素に比べpH 9.1、40℃で約1.7倍の活性を示した。変異酵素には５つのアミノ酸置換があり、このうち１つは活性中心近傍に位置していた。このシングルミュータントは酸性条件でのみ顕著に酵素活性を低下させた。残りの４つの置換は活性中心から離れて位置しており、立体構造のわずかな変化が活性向上に寄与することが示唆された。3）カラマツのキシラン、グルコマンナンの水溶性画分は、2,5-DMHQを介したFenton反応で低分子化し、ナミダタケの非酵素的分解系におけるキシラン、グルコマンナンの分解が明らかになった。また、3週間三角フラスコで培養したオオウズラタケから3つのセルラーゼ画分を分離し、カルボキシメチルセルラーゼを精製した。4）オオウズラタケのグルコシダーゼ粗酵素を分離し、p-ニトロフェニル-D-グルコピラノシドを基質として3日間酵素分解して反応の進行過程を調べ、６位に置換基を導入した基質が酵素分解速度を制御することを明らかにした。5）トウモロコシ芯粉末を主成分とするエノキタケ菌床は、培養前後でリグニン含量に変化はないが、グルコース、アラビノースが減少していた。γ線照射後の酵素糖化率は、60℃で乾燥した廃菌床、未乾燥の廃菌床ともに増加し、照射の効果は顕著であった。
• カテゴリ: えのきたけ 乾燥 とうもろこし