ドットブロットハイブリダイゼーションを用いたキクわい化ウイロイドの検定

• 担当機関: 兵庫県立中央農業技術センター
• 研究期間: 1996～1996
• 研究担当者: 塩飽邦子
• 発行年度: 1996
• 要約: キクわい化ウイロイド（CSVd）の遺伝子をクローニングし、そのクローンを鋳型としPCRでDIG標識DNAプローブを合成する。このプローブを使いドットブロットハイブリダイゼーションでＣＳＶｄを検定すると迅速、高感度に検出することができる。
• 背景・ねらい: 兵庫県では、逆転写－遺伝子増幅法（RT-PCR）を用いたキクわい化ウイロイドの検定方法を確立し、迅速で確実な検定法として普及員に指導し、農家のキクの検定に利用している。さらに、安価でより迅速な検定法として、DIG（ディゴキシゲニン）標識DNAプローブを用いたドットブロットハイブリダイゼーションによる検定法を確立する。

成果の内容・特徴

1. CSVd遺伝子をRT-PCRで増幅し、pUC119のSmaⅠサイトにクローニングし、これを鋳型にPCRでDIG標識プローブを作製する（図１）。
   　プライマーの配列：相補型；GCCCCAGCCGCGATCTCGTC、相同型；GACAGGAGTAATCCTAAAC
2. キク葉0.05gを緩衝液（0.5M NaCl、0.1M Tris-HCl、0.5%SDS、0.25%
   DIECA）で磨砕し、0.5mlのフェノール／クロロフォルムを加えRNAを抽出し、エタノール沈殿する。沈殿を乾燥後20μlの蒸留水に懸濁する。その2μlを変性してナイロン膜にスポット後、風乾する。ナイロン膜を120℃で30分間ベーキングした後、薄手のプラスチック容器に入れ、100℃で2分間変性したDIG標識プローブとハイブリダイゼーションする。酵素標識抗DIG体を結合させ、基質、発色剤を反応させて青紫色の発色を確認する。
3. CSVd接種株は青紫のスポットを示すが、無接種株はスポットができない（図２）。接種試料を段階希釈し、検定すると100倍から1,000倍の希釈でも陽性反応が確認できる（図３）。
4. 検定の精度は生物検定やRT-PCRと比べ同程度で、検定期間が1.5～2.0日と短く、１度に扱える検体数も多く（５０個体／１人）、優れた検定法である。

成果の活用面・留意点

1. この方法は微量の試料で短期間のうちに効率よく検定できるので、繁殖母本や培養幼植物の保毒検定にも適用できる。
2. 操作はやや煩雑で、技術的な熟練が必要である。普及に移す際は、試験場で研修することが望ましい。

• カテゴリ: 乾燥 きく 繁殖性改善