ドナー胚のガラス化保存技術

• 担当機関: 兵庫県立中央農業技術センター生物工学研究所
• 研究期間: 1998～2001
• 研究担当者: 浜田由佳子; 冨永敬一郎; 有吉哲志
• 発行年度: 1999
• 要約: 受精卵核移植のドナー胚として、体外受精４日目胚をガラス化保存し、融解後一日培養して核移植を行うと、胚盤胞への発生率が高い。核移植後の胚盤胞を移植して産子が得られる。
• 背景・ねらい: 受精卵クローン牛生産技術では、ドナー胚の確保が必要である。初期胚の生存性が高い超急速ガラス化保存法を用いて、体外受精後の初期胚をガラス化保存し、保存するドナー胚の発生日齢が核移植後の発生率に及ぼす影響を調べた。また、核移植によって作製した胚盤胞の移植による子牛生産を試みた。

成果の内容・特徴

1. 体外受精および体外培養はUllahらの方法（1997）に準じて行った。受精４日目と５日目の16～32細胞期胚を超急速ガラス化保存法で保存した。
   
2. ガラス化方法としてはVajtaらの方法（1998）を用いた。
   ガラス化液（0.6Mシュクロース＋20%エチレングリコール＋20%デムゾを含む20%血清加TCM199液）に胚を入れ、少量のガラス化液とともに胚をストローに吸引後、液体窒素へ浸漬して保存した。融解は、加温した0.25Mシュクロースを含む33%血清加TCM199液にストローを浸漬して行い、培養液へと移し変えた。４日目のガラス化胚は融解後１日間、５日目のガラス化胚は融解後短時間培養し、核移植に用いた。
   
3. 核移植用のレシピエント卵子を作成するために、未受精卵子を押し出し法で除核し、活性化処理を行った。ドナー割球をレシピエント卵子内へ挿入し、電気刺激で両者を融合させた。融合後の胚を７～８日間培養して発生率を比較した。
   
4. ガラス化保存するドナー胚の発生日齢別の核移植成績では、融合率には差がなく、分割率と胚盤胞率において、４日目ガラス化胚の方が有意に高かった（表１、図１）。
   
5. 経腟採卵技術で採取した卵子に体外受精を行い、４日目胚をガラス化し、８日間保存した。核移植の前日に融解し、一日培養した胚をドナー割球として核移植を行った。発生した３個の胚盤胞を３頭に移植した結果、１頭の産子が得られた（表２、図２）。
   

成果の活用面・留意点

　ドナー胚を随時融解して核移植が行えるため、計画的な核移植作業が可能になる。