カンキツにおけるDIG-AFLP法を利用した雌性不稔品種特異バンドの検出

• 担当機関: 和歌山県農林水産総合技術センター
• 研究期間: 2000～2001
• 研究担当者: 花田裕美; 萱野暁明（農林水産技術会議事務局）; 森 泰; 田部井豊（農業生物資源研究所）
• 発行年度: 2000
• 要約: RAPD法より再現性が高く、シークエンサーやRIを必要とせず、より簡便なnon-RIシステムを利用したDIGーAFLP法の開発を行い、カンキツ「無核紀州ミカン」雌性不稔品種特異バンドの検出に利用する。
• 背景・ねらい: 遺伝的類縁関係が高い品種間で遺伝的多型を検出する場合、より感度の高い手法が必要である。今回材料とした「紀州大平ミカン」、「無核紀州ミカン」、「紀州ミカン」は遺伝的類似度が高く、アイソザイムでは差異が認められないと言われている。また、この3品種は形態的に類似している。しかし、「無核紀州ミカン」は雌性不稔で果実に種子ができない特性をもつ。RAPD法より再現性が高く、遺伝的多型が得られやすいと考えられるAFLP法の利用を考えたが、通常のAFLPでは、RIもしくはシークエンサーが必要である。; そこで、Vossら（1995）の方法を改良し、より簡便でシークエンサーやRIを必要としない方法として、DIG-RAPD法より再現性の高いDIG-AFLP法の開発を行い、雌性不稔に関するDNAマーカーを作成するための「無核紀州ミカン」特異バンドの検出に利用する。

成果の内容・特徴

1. 　カンキツDNA抽出は5月の新葉を用い、液体窒素で粉砕後、改良CTAB法で行う。また、isogenを用いDNA抽出を行った場合、AFLPの再現性は悪くなる。（データ省略）
   
2. 　6塩基認識酵素選択プライマーの5’末端にDIG修飾を行い、AFLP反応後6%ポリアクリルアミド変性ゲル（200×400mm）で電気泳動を行い、ナイロンメンブレンフィルターに転写後、DIG発色反応（ロッシュ・ダイアグノスティック社）により多型バンドの検出を行う（図１、図２）。
   
3. 　Vossら（1995）の方法で利用されていた4塩基認識酵素Mse Ⅰ（TTAA)をMspⅠ（CCGG）に変更した場合、MseⅠと同程度の検出感度が認められる（表１）。
   
4. 　DIG-RAPD法と比較して、より多くの多型バンドの検出が可能であり、「無核紀州ミカン」品種特異的に検出される多型バンドの割合も高い。（表１、表２）
   
5. 　RI施設をつくるためには莫大な費用が必要であるが、本法では全ての行程を同じ実験室で行うことができ、さらに、シークエンサーが無くても行うことが可能である。
   

成果の活用面・留意点

1. 　DNAの精度により再現性が異なってくるので、DNA抽出法には注意が必要である。
   

• カテゴリ: DNAマーカー 品種 その他のかんきつ