ウシ体細胞核移植におけるドナー卵丘細胞の血清飢餓とロスコビチン処理との比較

• 担当機関: 兵庫農総セ
• 研究期間: 2002～2003
• 研究担当者: 柴谷増博; 大塚由佳子; 冨永敬一郎
• 発行年度: 2003
• 要約: ウシ体細胞核移植のドナー細胞に対するロスコビチン処理は血清飢餓と同等の再構築胚の発生成績及び受胚牛への再構築胚の移植成績が得られる。
• キーワード: ウシ、体細胞核移植、細胞周期、BrdU、ロスコビチン、再構築胚
• 背景・ねらい: 体細胞核移植を用いたクローン牛生産では血清飢餓処理が用いられているが、正常子牛の生産率が低いことが問題となっている。血清飢餓処理ではドナー細胞の細胞周期をG0期にコントロールするので、S期への移行が遅い。そのため、細胞周期をG1期に調整するcyclin ; dependent kinase(CDK)インヒビターであるロスコビチン(R)が検討され、血清飢餓処理より胚盤胞への発生率は低下するが、胚の細胞数が増加し、正常子牛の生産率も向上することが報告されている(Gibbons ; et al.、2002)。; そこで、血清飢餓処理とR処理とを比較するために、最初に、経腟採卵で得られた但馬牛継代卵丘細胞を用いて両処理後のS期への移行の時期を検討し、次に、核移植を行い、7日目及び8日目胚盤胞への発生率、7日目胚盤胞の細胞数と細胞構成を調べ、得られた再構築胚盤胞の一部を移植して正常産子への発生能を比較した

成果の内容・特徴

1. 6時間目以降にR処理は血清飢餓0.5%区及び0.05%区よりS期細胞割合が高く（P<0.05）(図1）、R処理を行った細胞は血清飢餓処理より処理解除後S期へ早く移行することが明らかとなった。
   
2. 経腟採卵により採取した卵丘細胞に由来する継代ドナー細胞を0.5% 血清(CS)添加DMEM液で4～7日間培養するか、あるいは10% CS加DMEM液に15μMRを添加して24時間培養する。
   
3. トリプシン-EDTAで剥離後、0.5%CSを含むPBS (-) 液あるいはR添加した同液に浮遊させた細胞を除核したレシピエント細胞質へ挿入する。
   
4. 30 V /0.15 mm 25 オsの電気刺激により融合させ、15分後、融合卵子に20 V/mm 20 オsの電気刺激により活性化処理を行う。10μg/mlシクロヘキシミド(C)と2.5
   μg/ml サイトカラシンBを含むCR1aa液で1時間処理後、Cのみを含むCR1aa液で4時間処理し、CR1aa液をベースとした発生培養液で8日目まで培養する。
   
5. 再構築胚の分割率、8細胞期胚率及び7・8日目胚盤胞率を計測した結果、融合率、分割率、胚盤胞への発生率では細胞周期調整法による差はみられい(図2)。
   
6. 免疫蛍光2重染色により内部細胞塊細胞(ICM)と栄養膜細胞とを別々に数え、7日目胚盤胞の細胞数及び細胞構成を比較した結果、胚盤胞の細胞数及び細胞構成では細胞周期調整法による差がみられない(図3)。
   
7. 再構築胚盤胞の移植による受胎率でも同様の成績となり(表）、正常子牛が得られる(図4)。
   
8. R処理はドナー細胞の細胞周期の調整を前日に行うことができ、血清飢餓と同様にドナー細胞の調整に利用できる。
   

成果の活用面・留意点

1. 体細胞核移植におけるドナー細胞の細胞周期の調整をＲ処理により前日に行うことができる。