イネいもち病菌の動態を個体レベルで追跡するためのＤＮＡマーカー

• 担当機関: （独）農業技術研究機構 九州沖縄農業研究センター
• 研究期間: 1999～2001
• 研究担当者: 山口純一郎（佐賀農業セ）; 中島 隆; 藤田佳克（九州研）; 平八重一之
• 発行年度: 2001
• 要約: イネいもち病菌菌株を特定するＤＮＡマーカーは、ＳＴＳ化することにより一般的ＰＣＲ法で安定に増幅されるため、いもち病菌動態の個体レベルの追跡に有効である。この際、鋳型ＤＮＡは、菌体をセルラーゼで処理するだけで効率的に調製できる。
• 背景・ねらい: イネの最重要病害であるいもち病菌において、個々の菌株の伝染過程や個体群としての動態については不明な点が多い。そこで、いもち病菌の動態を個体レベルで追跡するために、菌株に特異的なＤＮＡマーカーのＳＴＳ化およびその効率的検出法を開発する。
• 成果の内容・特徴: 1.; ともに21塩基からなるプライマーPJF3とPJR1組合せをもちいたＰＣＲ法（図1）によって増幅される約650bpの断片は、供試した500以上の菌株の中でKyu9439013株にのみ検出される（図2）。その他の菌株では、約165bpの断片が増幅されるか、断片の増幅が認められない（図2）。; 2.; このＤＮＡマーカーは、Kyu9439013株をイネ上で7回、培地上で50回継代した場合にも安定に検出される。; 3.; ＤＮＡマーカーをＳＴＳ化した後は、一般的なＰＣＲ法の増幅産物を電気泳動することによって目標菌株を識別できるため、従来のＡＦＬＰ法やＲＡＰＤ法における煩雑性あるいは再現性の問題が解決される。さらに、一反応に要するＤＮＡポリメラーゼは0.5ユニットで十分であり、例えば同量の反応液によるPot2 rep-PCR法に較べて5倍も経済的である。; 4.; このＤＮＡマーカーを用いると、他の菌株が混在する場合にも目標菌株を確認できる。従って、検定のための菌体は単胞子分離を必要としない。; 5.; ＰＣＲ反応に供試する鋳型ＤＮＡの調製法は、基本的には、少量の培養菌体を1％（w/v）セルラーゼを含む50mM Tris-HCl(pH7.4)、10mM EDTA液に懸濁し、37℃で90分間保つだけの操作であり、多数のサンプルを対象とする場合には極めて有効である（図3）。; 6.; 得られた鋳型ＤＮＡ液は、4℃・２週間の保存でも安定であり、余裕をもった実験設計が可能である。
• 成果の活用面・留意点: 1.; Kyu9439013株以外のいもち病菌株、あるいは他の病原微生物についても、特異的なＤＮＡマーカーをＳＴＳ化することにより、それらの生態解明に応用可能である。
• カテゴリ: いもち病 DNAマーカー